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(無題) 削除/引用 No.1950-9 - 2008/09/15 (月) 16:29:37 - EcoRI 抗体(精製する、ということなので、抗体はないのかもしれませんが)や酵素活性など、目的のタンパク質を検出できる系があることを前提として、 話を進めます。 >ゲルろ過に関しても考えたのですが溶出サンプルのボリュームが増えてしまう事と時間がかかってしまう事から候補として最後にしてしまいました。 と仰っていますが、 イオン交換で精製を予定しておられるのですね。 イオン交換ならば、供する液体の体積は問題になりません。 時間がかかる、ということは、液クロの機器はないのでしょうか？ もし、液クロがあれば、 ~さんが仰るように、培地中の成分を分離してから、イオン交換なさるのがよろしいかと。 このとき、どのフラクションに目的のタンパク質がくるかは、検討すべき項目です。 この段階で、検出する系が必要になります。A280のモニターでもいいかもしれませんが。 またゲル濾過を先にもってくるメリットとして、 目的タンパク質の溶媒を任意に設定できる、という点があります。 塩濃度がわからない培地から、ゲル濾過により、塩濃度が０のバッファーに置換してやることで、 続くイオン交換をスムーズに行えることが期待されます。 もちろん、塩濃度を０にする必要はなく、150 mM NaCl ぐらいから初めてもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1950-8 - 2008/09/15 (月) 15:41:41 - 染めQ 糖タンパクでpI=7.7は高い気がしますし、GENETYXで出したということは糖鎖部分が入ってないですよね。 糖鎖がどれくらい含まれるタンパクなのかは知りませんが、pH7.0で陽イオン交換にくっつかないことからもやはり糖鎖をいれたpIはもっと低いのではないでしょうか？ 培地や培養条件で糖鎖のつき方は大きく異なることがあります。 プロニックF-68は非イオン性ポリマー界面活性剤なので多少結合を阻害することはあるかもしれませんが、培地にふくまれる程度ではこれまでの経験上イオン交換精製でほとんど影響したことはありません。 糖タンパクであれば、培地中の塩濃度を考えても陰イオン交換でまずはスカウティングしてみてはどうでしょうか。

ご返信ありがとうございます 削除/引用 No.1950-7 - 2008/09/13 (土) 13:43:04 - K.Y ~ 様 Hybridoma SFMの界面活性剤の件、ありがとうございました。 ＞培地中の成分が問題なのであれば、先にゲルろ過をかけて培地中の低分子と分けてしまうのが早いかもしれませんね。 ゲルろ過に関しても考えたのですが溶出サンプルのボリュームが増えてしまう事と時間がかかってしまう事から候補として最後にしてしまいました。 また、低分子との分画という点から限外ろ過膜を使用して濃縮とバッファーで希釈する事で脱塩を行い、精製にかけてみましたがそれでもうまくいきませんでした。 少し話がずれてしまい申し訳ありません。。。

ご指摘ありがとうございます 削除/引用 No.1950-6 - 2008/09/13 (土) 13:33:53 - K.Y 染めQ様 Hybridoma-Serum Free Mediumの時の精製に用いたpHは7.0で同じくリン酸Naバッファーを使用しました。培地以外の条件は同じにしてあります。 ＞このタンパクは糖タンパクではありませんか？ 　糖鎖はついていますので糖タンパクになると思います。 糖タンパクの場合、何か影響があるのでしょうか？ ＞陽イオン交換に固執せず、他の担体でやるのも手かと思います。 　確かに、陽イオン交換の精製以外の方法を考えております。 現時点では硫安沈殿をしようと考えています。 色々とご指摘して頂きありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1950-5 - 2008/09/13 (土) 12:02:27 - ~ Invitrogen社のHybridoma SFMには界面活性剤(おそらくプルロニックF68)が入っていますので、 界面活性剤の影響ではありませんね。 培地中の成分が問題なのであれば、 先にゲルろ過をかけて培地中の低分子と分けてしまうのが早いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1950-4 - 2008/09/13 (土) 11:47:00 - 染めQ >[Re:3] K.Yさんは書きました : > 　はい、Hybridoma-Serum Free Mediumで発現させた後、同じ担体を用いて精製を行った所、担体にタンパク質が結合する事は確認できました。 このときの条件は？pHは？？ このタンパクは糖タンパクではありませんか？ そもそもHybridoma-Serum Free MediumにはPF-68は入ってないのでしょうか？ また培地が違えばモノも変わる可能性があります。 陽イオン交換に固執せず、他の担体でやるのも手かと思います。

ご返信ありがとうございます 削除/引用 No.1950-3 - 2008/09/12 (金) 22:35:13 - K.Y 　はい、Hybridoma-Serum Free Mediumで発現させた後、同じ担体を用いて精製を行った所、担体にタンパク質が結合する事は確認できました。 ですがCD OptiCHO mediumの方がタンパク質発現量が高いのでどちらが良いか迷っておりました。。。 界面活性剤に関しては気に留めておりませんでした。 投稿して頂きありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1950-2 - 2008/09/12 (金) 22:00:04 - ~ 他の、例えばウシ血清入りのDMEMなどではその条件で精製できるのでしょうか？ 出来るのであれば、CD OptiCHOに含まれているプルロニックF68によって、 担体との結合が阻害されているのかもしれません。

CD OptiCHO mediumの培養上清からの精製について 削除/引用 No.1950-1 - 2008/09/12 (金) 18:14:53 - Ｋ．Ｙ CD OptiCHO mediumを用いて細胞の培養を行いタンパク質発現後、陽イオン交換体を用いてバッチ精製を行っています。 培地は細胞の培養によってpHが変動し、また培地自体の塩濃度によって担体にタンパク質が結合しない事が予想される為、精製に用いるバッファーで培地を希釈する事でpHを一定にし塩濃度を下げています。 培地の希釈操作を行った後、平衡化を行った陽イオン交換体(Macro CAP SP/SP-XL)を用いて精製しているのですが、、、 SDS-PAGEで確認した所、担体にタンパク質が結合していない事が判明しました。 この後、希釈するバッファーのpHを下げ再度試みましたがSDS-PAGEで確認した所、結合しておりませんでした。 GENETYXのソフトによるとタンパク質の等電点は7.7でした。 今回、培地の希釈と精製に用いたバッファーは ・pH7.0　10mM リン酸Naバッファー　 ・pH6.0　10mM リン酸Naバッファー　 ・pH5.0　10mM 酢酸Naバッファー の3種類を用いましたがうまくいきませんでした。 希釈した培地のpHの確認は行っております。 担体にタンパク質が結合しない原因は何なのでしょうか？？？ 宜しくお願い致します。

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