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(無題) 削除/引用 No.1940-9 - 2008/09/14 (日) 16:34:21 - ちび 皆さん、こんにちは。 　その後のWBの実験で、やはり原因は抗体溶液であることがわかりました。抗体が凝集して黒いドットを形成していたようです。 　なお、前回ドットを形成したのと同じサンプルでWBを行い、改善されていましたのでサンプルの感染などの原因ではなかったようです。 　 　私の質問に親切に答えていただきまして、皆さん本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1940-8 - 2008/09/12 (金) 11:07:07 - アルフォンス バクテリアのコンタミによるドットではないかと。

(無題) 削除/引用 No.1940-7 - 2008/09/11 (木) 17:49:54 - ちび blockingはO/N振とうしながら行っております。しかし確かにblockingの際に、細かい泡がたっていることがありますので、その点も注意していきたいと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1940-6 - 2008/09/11 (木) 17:16:05 - - Blockingの際、溶液に細かい泡があったりすると、それがメンブレンにくっついてそこだけブロッキングされずドットのようになることもあるかと思います。ブロッキングは４度O/Nとのことですが震盪されてますか？そうでないと泡がくっついたままということもあるかと。

(無題) 削除/引用 No.1940-5 - 2008/09/11 (木) 15:53:17 - ちび 皆さん、早速のご返事本当にありがとうございます。 早速、抗体の溶液を遠心した後に試してみようと思います。student様の言われた方法も試してみようと思います。 　また、検出にはECL-plus,ECL-advanceでもない普通のECLを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.1940-4 - 2008/09/11 (木) 15:32:39 - ＤＮＡＩ 検出は何でなされてますか？ 感度が高いと不溶化した二次抗体により黒い斑点が出現します。おおさんのおっしゃる通り、遠心で改善するかもしれません。 別のケースでは、ECL-Plusではバックも無くきれいに検出できたサンプルが、ECl-Advance（抗体量は1/10〜20）では黒い斑点が前面に出現しました。遠心しても消えず、違う二次抗体を使用したら斑点が消失しました。 発光系をお使いならＡＴＴＯのＨＰにテクニカルレポートがありますので御参照を。

(無題) 削除/引用 No.1940-3 - 2008/09/11 (木) 15:22:59 - student 個人的な経験ではだいたいそういったドット状の汚れは抗体液に含まれる不純物が原因だと思います。 他の一次抗体のＷＢでは出ないのではないですか？ おお様もおっしゃっている通り、遠心してから抗体を使用してみるのが簡単な手です。 または、メンブレンに当てる前の抗体液を別の転写していないメンブレンにつけて、メンブレンの非特異を取ってから目的の転写したメンブレンに当てるといいかもしれません。 どうしようもないときはどうしようもないです。

(無題) 削除/引用 No.1940-2 - 2008/09/11 (木) 15:16:17 - おお ラテックスなどの手袋についているパウダー、抗体溶液が何らかの理由でにごったり、沈殿物があるなどが理由として今思いつきます。 後者の場合抗体溶液を遠心して上ずみを使うといいかと思います。濁ったりしてるように見えなくても遠心でのぞけるばあいもあるとおもいます。 メンブレンについたゲルもバックグランドの原因にはなると思いますが、、そんなにくっついてますか?

ウェスタンブロッティングのご相談 削除/引用 No.1940-1 - 2008/09/11 (木) 14:56:54 - ちび 　こんにちは。初めて投稿します。 現在、細胞から蛋白を抽出して私たちの教室で注目している酵素の一次抗体(モノクローナル抗体)を用いてウェスタンブロッティング(以下WB)を行っております。 　その際、出来上がりの現像の段階で、バンドでもなくゴミのような黒いドットがあちらこちらに(目的のバンドの高さと関係なく)現れるようになってきました。色んな原因を考えましたが、全くわかりません。皆さんの意見をお聞かせください。 ちなみに、私どものWBの方法は SDS-PAGE→ゲルを転写のbufferに15分つけて→ セミドライ法でニトロセルロース膜に転写→5％のskim milkでovernightのblocking(4℃)→ 一次抗体(1000倍希釈)4℃でovernightの反応(membraneはパウチして）→ 0.1%TBS-Tでwashしたのち二次抗体(抗マウス10000倍希釈)室温で一時間→ その後、0.1%TBS-Tで計50分間wash(かなり長めにしました)、その後現像です。 　現像液等の汚れなどを解消してもやっぱり汚いドットは現れます。membraneについたゲルのカスやbufferの結晶などが原因なのでしょうか？washはかなり長めにしているつもりですが…。

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