普通のTaq polで増えるのに、proof-reading活性のあるやつだと増えなくなるという場合、考えられることの一つとして、
proof reading 活性のあるpolymeraseだと、試薬を加える順番や手際によって、3'-5'exonuclease活性でprimerが分解されて、増えなくなるとか、特異性が下がってエクストラバンドが出やすくなる可能性があります。
具体的にはprimerと酵素を共存させた状態で(とくにdNTP非存在下で)サーマルサイクラーにかけるまでに長時間置くと危険性があります。最後に酵素を加えたたら(あるいはprimerを最後に加えたら)速やかに反応を始めるべきです。
そのへんは問題ありませんか?(まあ、それでまるっきり増えなくなるとは考えにくいのですが)。念のため、primerをふだんより多めにするのもいいかもしれません。 |
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