全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1939-6 - 2008/09/11 (木) 15:45:56 - おお >また、どのくらいのインサートＤＮＡの精製純度がライゲーション効率に影響を与えるのでしょうか。 むかしは、反応がうまく行かないようならフェノール、クロロフォルム、エタチンしろといった工合です。 プラスミドはアルカリライシス法で、フェノール、クロロフォルムエタチンで大抵こなしていたと思います。 酵素などによっては、酵素処理後フェノール、クロロフォルムエタチンしてもDNAに結合したままで悪さする可能性とかあるのでPK処理をかます場合があります。 今はたいていキットでしょうし、そのグレードの精製度であれば問題ないと思います。もちろん酵素処理したあと、次のステップに入る時はケースバイケースだとおもいます。フォスファターゼを持ち込みたくないので、ライゲーション前のプラスミド断片は慎重にするひともいます。

(無題) 削除/引用 No.1939-5 - 2008/09/11 (木) 15:24:22 - aji 偶然ですが、この効率を調べるような実験をしてしまいました。 10kbのベクターに恒常発現するようなGFPの入った1.5kbのインサートをライゲーション、平滑端でもちろん脱リン酸化は行っていません。ベクターとインサートの比にも拠りますが、50-100個に一個ぐらい光る、というか黄緑のコロニーが得られました。 大腸菌でのプラスミド作成にミニプレップ100個はしたくないですよね。

(無題) 削除/引用 No.1939-4 - 2008/09/11 (木) 15:07:00 - おお >[Re:1] マロさんは書きました : > 　制限酵素EcoRVで切断したベクター（６．７ｋｂ）と平滑末端のインサート（２ｋｂ）とのライゲーションにおいてお聞きします。ベクターの脱リン酸化を行わないと、ライゲーション効率はかなり悪くなるまたは全くライゲーションができなくなるのでしょうか。 インサートが入っているプラスミドを見つけるのが大変になります。インサートが入るライゲーションのほうがセルフライゲーションより効率が悪いですから脱燐酸して、自己閉環をふせいで、インサートが入ったやつだけライゲーションするようにしているわけです。 もしライゲーションし、インサートがはいるとEcoRV認識配列がつぶれるならば、脱燐酸化を行わずに、ライゲーションしEcoRVで切断すれば、セルフライゲーションしたプラスミドを直さにもどすことができます(インサートにEcoRV認識配列がないことが前提です)。

(無題) 削除/引用 No.1939-3 - 2008/09/11 (木) 14:53:39 - ~ >ベクターの脱リン酸化を行わないと、ライゲーション効率はかなり悪くなる 悪くなるでしょう。 一度、 >また脱リンしていない平滑末端ベクターはどのくらいの時間でベクターが閉環してしまうのでしょうか。 ライゲーション時のことですよね。 数秒から一晩くらいでライゲーションされるでしょう。 ライゲーションされず、DNAフラグメントが単体で置かれているのであれば、 いつまで経っても閉環はしないでしょう。 >どのくらいのインサートＤＮＡの精製純度がライゲーション効率に影響を与えるのでしょうか。 どのような精製方法をすることが前提での質問ですか？ 現在市販されているカラムで精製すれば、問題のある純度にはならないでしょう。 QIAEXIIのビーズでの精製は良くないという話を聞いたことがありますが、私が使っている限りは問題が生じたことはありません。

(無題) 削除/引用 No.1939-2 - 2008/09/11 (木) 14:46:24 - student > 　制限酵素EcoRVで切断したベクター（６．７ｋｂ）と平滑末端のインサート（２ｋｂ）とのライゲーションにおいてお聞きします。ベクターの脱リン酸化を行わないと、ライゲーション効率はかなり悪くなるまたは全くライゲーションができなくなるのでしょうか。 当たり前のことですが、脱リン酸化していないとかなり自己環状化するので、ライゲーションは出来ますが、インサートの入ったものをとるのは難しいです。 また脱リンしていない平滑末端ベクターはどのくらいの時間でベクターが閉環してしまうのでしょうか。 質問の意味がよくわかりませんが、普通のライゲーションは３０分でできますよね。条件によりますが。 > 　また、どのくらいのインサートＤＮＡの精製純度がライゲーション効率に影響を与えるのでしょうか。 一般的に使用されているゲルからのＤＮＡ切り出しのキットや、フェノクロの純度で十分です。ＴＡクローニングの場合でもＰＣＲの酵素が少し混ざっていてもそのままライゲーションしたことあります。ただ精製したほうが効率はよいと思いますが。

平滑末端ライゲーション 削除/引用 No.1939-1 - 2008/09/11 (木) 14:17:38 - マロ 　制限酵素EcoRVで切断したベクター（６．７ｋｂ）と平滑末端のインサート（２ｋｂ）とのライゲーションにおいてお聞きします。ベクターの脱リン酸化を行わないと、ライゲーション効率はかなり悪くなるまたは全くライゲーションができなくなるのでしょうか。また脱リンしていない平滑末端ベクターはどのくらいの時間でベクターが閉環してしまうのでしょうか。 　また、どのくらいのインサートＤＮＡの精製純度がライゲーション効率に影響を与えるのでしょうか。 ご回答お願いします。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---