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PNKによるリン酸化反応時のヌクレオチド残基について トピック削除
No.1937-TOPIC - 2008/09/11 (木) 11:29:02 - N
いつもお世話になっております。
核酸の基本的な事が分かっていないのかもしれないのですが、PNKでリン酸化を行なう際にはいつもガンマーATPを用いていますが、代わりにガンマーGTP、CTP、TTPなどで代用する事は出来るものでしょうか。また、PCRの時に用いるdNTPで代用出来ますでしょうか。
いつも基本的な事ばかりで恐縮ですが、ご教授をよろしくお願い致します。
 
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.1937-6 - 2008/09/11 (木) 18:03:42 - N
みなさま、多くの貴重な情報をお教え頂き本当にありがとうございます。
タカラのPNKの説明書にはガンマATP標識の実験例が書かれておりますが、基質についての記載は特に無く付属でも付いていないので、3リン酸がついた残基ならとりあえず良いのかなあと漠然と思いながら使っていたものでした。
おお 様からお教え頂いたように文献的には他の残基でも大丈夫そうですが、_‐様Pumpkin様からお教え頂いた資料を見るとやはりガンマーATPが最も良いようなので注文してから実験する事に致します。平滑末端のリン酸化でもあり反応も進みにくいと思われたのですが、ちょうど切らしていたため、他のものでも良いのではないかと日頃の疑問が出てきましたもので。
大変勉強になり、助かりました。
どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1937-5 - 2008/09/11 (木) 15:00:55 - Pumpkin
~様、おお様がさらに詳しく出典を追加していただいておりますが、核酸のリン酸化を通常と同程度に(rATP使用)代用できるかとの点から、代用できることを証明するための実験をしなければならないことはナンセンスであるように思います(お二方も触れておられますが)。

rATPが不足しそうなので、dNTPで代用しようという程度であれば、すぐにrATPを注文されたほうがいいように思います。もちろん、dNTPでやらなければならない実験を計画されているのであれば、皆様の出典をご参考にされるとよいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.1937-4 - 2008/09/11 (木) 14:00:59 - おお
Novogrodsky A, Tal M, Traub A, Hurwitz J.
The enzymatic phosphorylation of ribonucleic acid and
deoxyribonucleic acid. II. Further properties of the 5'-hydroxyl
polynucleotide kinase.
J. Biol. Chem. 241 (1966) 2933-43.

上記論文からの抜粋です。
A、U、G、CTPで同じような活性がみられたとしています。
またgamma-32PATPからの32Pの核酸への取り込みはコールドのATPだけでなくdATPでも見られたことからdATPも燐酸のドナーになる可能性をしてきしています。

The phosphorylating agent was not limited to ATP since GTP,
UTP, and CTP were equally effective as phosphate donors with
DNA as the acceptor (Table III). Similar results were obtained
with RNA as the phosphate acceptor. The K, (millimicromoles
per ml) and Vmax (micromicromoles per 15 min) with each of the
nucleoside triphosphates were: ATP, 14.3 and 40 (see Fig. 3);
UTP, 15 and 33.3; GTP, 33.3 and 66; CTP, 25 and 52, respectively.
At all of the stages of purification, addition of unlabeled
ribonucleoside triphosphates inhibited the phosphorylation of
any of the phosphate acceptors by any labeled nucleoside triphosphates.
This inhibition was also observed with the deoxynucleoside
triphosphates. p,+P-dATP was as effective as
ATP in the phosphorylation of DNA. However, 32P inorganic
polyphosphate was inactive as a phosphate donor. These results
indicate that a variety of different nucleoside triphosphates are
capable of replacing ATP in the kinase reaction.

どんな実験を考えているか分かりませんが、、なるべくATPでやるようにするのがいいとおもいます。というかあまり変える勇気はありません。もし必要でそのような実験をするなら、系が働くが一度見てからのほうがいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.1937-3 - 2008/09/11 (木) 13:59:59 - ~
うちでリファレンス1が読めないので実用上使えるかどうかは分かりませんが、
CTP, GTP, TTP, UTP, dATP or dTTPは効率はともかく使えるのでは?
http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0236.asp

あえて使用するメリットがあるのかは疑問ですが。

(無題) 削除/引用
No.1937-2 - 2008/09/11 (木) 13:22:11 - Pumpkin
>ガンマーGTP、CTP、TTPなどで代用

rATPでなければなりません。

>dNTPで代用

できません。

あなたの用いるT4PNKの使用説明書やカタログにはどのような記載があるでしょうか。基質はrATPと記載されていませんか。

参考までに、この酵素についての情報についてリンクを載せます。その酵素がどのような反応を触媒し、その反応経路を把握しておくことは実験において重要なことだと思います。
http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bget?ec:2.7.1.78

PNKによるリン酸化反応時のヌクレオチド残基について 削除/引用
No.1937-1 - 2008/09/11 (木) 11:29:02 - N
いつもお世話になっております。
核酸の基本的な事が分かっていないのかもしれないのですが、PNKでリン酸化を行なう際にはいつもガンマーATPを用いていますが、代わりにガンマーGTP、CTP、TTPなどで代用する事は出来るものでしょうか。また、PCRの時に用いるdNTPで代用出来ますでしょうか。
いつも基本的な事ばかりで恐縮ですが、ご教授をよろしくお願い致します。

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