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(無題) 削除/引用 No.1934-9 - 2008/09/19 (金) 18:08:40 - ema ＞神経のようなfibrousな組織でもvortexだけで壊れるのでしょうか？ 小さいというのがどれくらいかによりますが。たしかに神経本体はちょっと溶けにくいかも。とはいえしっかりした組織はペストルだとあんまり効果がなかった気が。もし知り合いの範囲でBeadsのミキサー（ホモジナイザー）があれば。 ＞nanoキット、picoキット両方を用いて、degradationしていることが確認されました。 組織をとるとこが重要ですね。せめて氷上で作業するか、いっそのこと乳児マウスごとRNAlaterにつけて作業するとか。

御返答 削除/引用 No.1934-8 - 2008/09/18 (木) 23:19:28 - GA お返事有難うございます。 >少量でphenol系試薬ならVortexでもOKです。通常の組織の場合はビーズ破砕をしています。量が少ないならphenol800ulより減らして（300ulとか）破砕して、その後液量を増やしても。 神経のようなfibrousな組織でもvortexだけで壊れるのでしょうか？経験がありませんのでお尋ねしています。あとホモジェナイズの際には300-500ulのIsogen内で破砕して、最終800ulまでメスアップしています。 >測定できないもの（サンプルとしても18S, 28Sのピークなし） のときのbioanalyzerの検出はnanoキットですか？分解してでないこと（低い方に全体的に分解ピークがある）以外に検出以下なのでみえなくてpicoキットを使えばみえることも。 残念ながらnanoキット、picoキット両方を用いて、degradationしていることが確認されました。 >坐骨神経とかを採取してRNA抽出した場合、そのRNAの大部分はシュワン細胞とか線維芽細胞由来になると直感的には思うのですが、それで良いのでしょうか？ そう考えています。特にSchwann cellでの遺伝子発現について調べたいと思っており、この方法を取っています。もし何か問題をお感じでしたらお教えください。

(無題) 削除/引用 No.1934-7 - 2008/09/18 (木) 13:49:04 - yt 門外漢なので教えて欲しいのですが、 　 坐骨神経とかを採取してRNA抽出した場合、そのRNAの大部分はシュワン細胞とか線維芽細胞由来になると直感的には思うのですが、それで良いのでしょうか？

ホモジナイズ 削除/引用 No.1934-6 - 2008/09/17 (水) 16:46:53 - ema 少量でphenol系試薬ならVortexでもOKです。通常の組織の場合はビーズ破砕をしています。 量が少ないならphenol800ulより減らして（300ulとか）破砕して、その後液量を増やしても。 くどいようですがmicroarrayにするなら、できればphenol系の後にカラムをかけてください。 きれいにとれていればそんなにロスりません。 ＞測定できないもの（サンプルとしても18S, 28Sのピークなし） のときのbioanalyzerの検出はnanoキットですか？分解してでないこと（低い方に全体的に分解ピークがある）以外に検出以下なのでみえなくてpicoキットを使えばみえることも。 増幅かけるならpicoキットレベルで十分です。

追記 削除/引用 No.1934-5 - 2008/09/14 (日) 18:56:03 - GA 少し別の方と相談していて、 （その方は大動脈などからのRNAを抽出している） 助言をいただきました。 Lithium Ureaによるcardiac perfusionを行い、 RNaseをブロックした後で組織を取るそうです。 その後はキットなども用いず、オーソドックスなフェノール・クロロホルム抽出を行うらしいです（正式なプロトコールが見つからなかったとのことで、来週にでも再度話し合うことにしました）。

お返事有難うございます 削除/引用 No.1934-4 - 2008/09/11 (木) 23:11:06 - GA BioanalyzerでのRINですが、 測定できないもの（サンプルとしても18S, 28Sのピークなし）から 最高でも7.2程度でした。 培養細胞系ではanalyzeしたことがないので、 どの程度の値が出ているかはわかりません。 （マイクロアレイは初めてで、このようなbioanalyzerを用いたのも初めてでした。） 解剖についてですが、 当方の施設ではcold roomがないのでRTで行いました （マウス自体を氷上に置くなどの処置はしませんでした）。 両側の坐骨神経を取るのですが、乳児マウスを用いるのもあるので、5分程度かかってしまいます。なお、サンプル採取後は即座に液体窒素に入れ、RNA抽出まで凍結したままです。 RNA laserはまだ用いたことがなく、想定外でした。 考えていてさらに気になった点は、ホモジェナイズのステップです。 このような極少量のfibrousな組織の場合、どのようなホモジェナイズ方法を取っておられるのでしょう？　私はハンディータイプの回転刃式のホモジェナイザーを用いているのですが、サンプル量に比して大き過ぎるような気もしています。

RNA精製 削除/引用 No.1934-3 - 2008/09/11 (木) 15:39:47 - ema もともと抽出はアレイメーカーの推奨はフェノール系で抽出しその後カラム精製です。ダイレクトにカラムは指定されてません。Q社のRLTは他の組織を溶かしてても溶けが悪いとおもうことがあります。 RINさえよければ、昔のように大量のRNAは必要ないのでなによりも品質です。 量が少ないときにはクロロホルムを入れて遠心、水層を回収、エタチンのときにグリコーゲン、エタチンメイトなどのキャリアーを入れる（エタチンメイトなら3ul maxで1ul/100ul水層）と収量があがります。 増幅かけていいのでしたらアレイは10ng位から始められます。（実験的には１セルからのアレイもあるくらいです） 抽出注意点はseaさんとおなじで組織から取り出して抽出に持ち込むまでが勝負です。生検サンプルはほぼここで優劣が決まります。取り出しに気を使うのはもちろん、すぐさま凍結するなりRNAlaterを使うなりの工夫をしては。

(無題) 削除/引用 No.1934-2 - 2008/09/11 (木) 09:08:11 - sea bioanalyzerでのRINはどれくらいですか？ 培養細胞からRNA抽出でRINが10近く出せるだけの系を使っていても この末梢神経からの単離でdegradationが強い、ということであれば 多分末梢神経単離のステップで時間がかかっているんじゃないかな、 と思います。 マウスをsacrificeしてからどれくらいの時間で神経の単離は 終わっていますか？操作は室温でやっていますか？ それともcold roomでやっていますか？ RNA laterを使うと単離ステップに支障が出ますか？ あとは神経に詳しい先生方に。

末梢神経からのRNA抽出 削除/引用 No.1934-1 - 2008/09/11 (木) 01:50:09 - GA 以前、同じようなスレッドを立ち上げられていた方がいらっしゃったのですが、 尻切れになっていたようですので、改めて挙げました。 よろしくお願いします。 現在マウスの末梢神経（坐骨神経など）からRNAを抽出し、 microarrayを行おうとしています。 Isogenでは何とか抽出でき（それでもtotalで400-500ng程度ですが）、 qRT-PCRのサンプルなどとしては十分足りうる量、質となっています。 ただ、microarrayのqualityをagilent bioanalyzerなどで調べると、 degradationしたサンプルも多く、使えない状態になっています。 （18S, 28Sの分画が少ないのも多いのですが。） Isogenのプロトコールのうち、 はじめのIsogenを800 micro literに減じた以外はプロトコールに従っています（収量が少ない場合には初期isogen量を減じることが推奨されていましたので）。 また、キットを用いなかった理由は、 Ｑ社のmicroRNAeasy kitでは、全くRNAが抽出できなかった経験があったためです（本当にゼロでした・・・）。 Microarrayに使える十分な質、量を有する末梢神経RNA抽出法について、ご教授いただければ幸いです。

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