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分子量の大きいSDS-PAGE トピック削除
No.1933-TOPIC - 2008/09/10 (水) 21:17:56 - かん
今度、Molecular Wt.350kDa　の大きなタンパクをSDS−PAGEで流してみてみたいと思っています。

しかし、今まで60前後のものしかみたことがなく、350ではどのゲル濃度でやったらいいのかよくわかりません。
本を見ると5%ゲルでも〜205kDaのものまでしかみれないと書いてあったので、もっと3%ととかにゲル濃度を下げて見たほうがよいのでしょうか？

ただ、あまりゲル濃度を低くしすぎると、固まらなかったり、ゲルがすぐちぎれてしまうのではないかと心配です。

みなさんどのように行っているのか教えてください。
　
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No.1933-10 - 2008/09/15 (月) 01:11:32 - 通りすがり
Molecular ProbeからでているRhinohideという溶液を使うと、5％アクリルアミドでも取り扱いやすいくらいの固さになりますよ。アガロースより強いです。http://probes.invitrogen.com/handbook/sections/0904.htmlの下の方にあります。後、たぶん、ビスアクリルアミドの割合を上げても良いはずですが、やったことはありません。

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No.1933-9 - 2008/09/14 (日) 10:34:40 - AP
本筋とは全く関係ありませんが

>今度、Molecular Wt.350kDa　の大きなタンパクをSDS−PAGEで流してみてみたいと思っています。

「分子量350000のタンパク質」と言うか、「350 kDaのタンパク質」と言うべきですね。分子量は無名数（単位なし）、Daの定義は分子量とは異なりますので、「Molecular Wt.350kDa」という表現は誤りです。

(無題) 削除/引用
No.1933-8 - 2008/09/12 (金) 01:12:02 - 通りすがり
普通のゲルで大丈夫です。
６％で長時間泳動すれば可能。
それか4-15％とかのグラジエントゲルでも可能でしょう。

(無題) 削除/引用
No.1933-7 - 2008/09/11 (木) 23:48:49 - マイオスタチン
今さらですけど、低濃度のアクリルアミドにアガー（finalで0.5％）を加えると扱いやすいゲルができますよ。

また、高分子を転写している論文は多く存在するので探してみてください。

(無題) 削除/引用
No.1933-6 - 2008/09/11 (木) 11:05:06 - かん
みなさんありがとうございます。

SDS-PAGEを行った後、PVDFメンブレンへTransferしてウエスタンでみます。

とりあえず、6％のゲルで長めに流してやってみたいと思います！
ありがとうございました！

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No.1933-5 - 2008/09/11 (木) 00:22:02 - page
InvitrogenのTris-Acetate Gelだと400 Kはいけますよ。もうひとつ、InvitrogenのNative Gelだと1000 Kから2000 Kは大丈夫です。Blue Native PAGEですが、操作は簡単です。もちろんBN-PAGEはコンプレックス用というイメージがありますが、分子量が大きいタンパク質に対しても有効なシステムです。
参考までに。

(無題) 削除/引用
No.1933-4 - 2008/09/10 (水) 23:20:49 - おお
5%で行けると思いますけどね。6%でも何とかなると思うのですが、、、、
Westernですかそれとも単なるSDSPAGEでしょうか?
まずゲルを作成するプレートをキレイにしてください。ゲルがこびりついて乾燥してたりすると、次にゲルを作ったときに、プレートからはがれなかったりします。6%以下になるとこういうのが致命的になります。シリコナイズするともっとはがれやすくなるので扱いやすいかもしれません。

ウエスタンだと、ゲルがメンブレンにこびりつくことがあります。でもこすり取って大丈夫と聞いています。

(無題) 削除/引用
No.1933-3 - 2008/09/10 (水) 23:11:57 - とおりすがり
6%あるいは3-8%ゲルでいいと思います。
フロントダイが流れきってから、さらに45分くらい泳動すれば350 kDaなら見られるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1933-2 - 2008/09/10 (水) 23:05:52 - うーん
アガロースでエイドウは出来ないでしょうか？
以前750ｋほどのたんぱくをみていました。

分子量の大きいSDS-PAGE 削除/引用
No.1933-1 - 2008/09/10 (水) 21:17:56 - かん
今度、Molecular Wt.350kDa　の大きなタンパクをSDS−PAGEで流してみてみたいと思っています。

しかし、今まで60前後のものしかみたことがなく、350ではどのゲル濃度でやったらいいのかよくわかりません。
本を見ると5%ゲルでも〜205kDaのものまでしかみれないと書いてあったので、もっと3%ととかにゲル濃度を下げて見たほうがよいのでしょうか？

ただ、あまりゲル濃度を低くしすぎると、固まらなかったり、ゲルがすぐちぎれてしまうのではないかと心配です。

みなさんどのように行っているのか教えてください。
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