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(無題) 削除/引用 No.1930-9 - 2008/09/11 (木) 14:54:52 - p DSPなど、抽出前の生細胞にたいしても有効な架橋剤を使う手があります。その場合その抗体のエピトープが複合体状態でも抗体がアクセスできる場所にあるかどうかが成否をわける鍵になります。ゆえにポリクローナル抗体の方が成功する可能性は高くなると思います。上記の理由で抗体が使えなさそうなときでも、架橋後にSDSなどでいったん変性してから再び希釈してIPする方法ならばうまくいく可能性は出てくると思います。

(無題) 削除/引用 No.1930-8 - 2008/09/11 (木) 14:14:39 - qq >具体的に、ゆるく集合をした膜タンパク質を壊さず抽出してく >るのに適した界面活性剤がありましたら教えてください。 そんなものはないのですよ。 あなたのケースで最適な条件が1%TRITONとは思えないなあというのが、感想です。 1%TX100で複合体が残っているのは、私としては極めて強い複合体だと感じます。 可溶化条件として、 tritonX100、NP40　（0.5%程度で抽出して、0.1%でIPとか） tween20　　　　（tritonよりマイルドな感触があります） octylglucosideやdodecylmaltoside（BN-PAGEの可溶化条件） CHAPS digitonin　（β受容体の可溶化剤） あたりは考えてもよろしいのではないでしょうか？ いずれにしても、必要十分でさらに、過剰でない界面活性剤濃度を決めないと、”ものすごくゆるく集合した膜タンパク質複合体”を取ってくるのは、難しいのではないでしょうか？ このあたりの検討はすでに行われているようでしたら、役立たずのresとお考え下さい。

(無題) 削除/引用 No.1930-7 - 2008/09/11 (木) 11:07:17 - chromatin >[Re:5] qqさんは書きました : > tritonから他のdetergentに変える試みもあるかもしれません。 具体的に、ゆるく集合をした膜タンパク質を壊さず抽出してくるのに適した界面活性剤がありましたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1930-6 - 2008/09/11 (木) 10:25:10 - EcoRI レジンや支持体に非特異に吸着する物質を除くために、 Cell Lysateを、抗体をつけていないレジン(Protein G Sepahroseとか)と一緒にインキュベートし、 しかるのち、遠心して、その上清を、抗体をくっつけたレジンとインキュベートすれば、 非特異な吸着は抑えられると思います。 その際、遠心して得られた沈殿にSDSサンプルバッファーを適当量加えて、ボイルして、 SDS-PAGEにかけてやれば、レジンに非特異的に吸着するタンパク質があると、示すことができると思います。

(無題) 削除/引用 No.1930-5 - 2008/09/11 (木) 10:01:43 - qq wash bufferのtritonを１％から0.1%に変えます。 IPやlysisのtritonもできる範囲で低くします。 tritonから他のdetergentに変える試みもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1930-4 - 2008/09/10 (水) 23:11:42 - おお >[Re:3] chromatinさんは書きました : > 一度、IP buffer, wash bufferの塩濃度を50mMでやってみたのですが、ノンスペが増えすぎていまいちうまくいきませんでした。 ノンスペは2種類あるかもしれませんね。タンパクの非特異なゲル(レジン、支持体)への吸着、タンパク同士の吸着。大抵は塩濃度をNa+だと150mMくらいK+だと100mMぐらいでほぼ生体内のイオン強度になると考えそれを基準に濃度を決めていると思います。それでも非特異が出る時は普通は塩濃度をあげます。電荷による結合を切るためです。

(無題) 削除/引用 No.1930-3 - 2008/09/10 (水) 18:26:36 - chromatin ＞特に疎水結合を強めるには高い塩濃度がいいですし、イオン結合を強めるには低い塩濃度の方が有利です。 塩濃度とタンパク質の関係についていまいち理解できていないので、御教授願えるとうれしいです。 一度、IP buffer, wash bufferの塩濃度を50mMでやってみたのですが、ノンスペが増えすぎていまいちうまくいきませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1930-2 - 2008/09/10 (水) 16:58:40 - おお クロスリンクがいいかもしれません。 あとは界面活性剤をいろいろ変えてみるのが選択肢だと思います。 界面活性剤の相性はその複合体によりますので一概にどれがいいといえませんが、 選択肢として電荷が中性のもの(オクチルグルコシド、ブリッジとか、、中性のものは比較的マイルドなものが多いので) ステロイド骨格のもの、(ジギトニン、CHAPS、デオキシコール酸とか、、疏水性に結合する様式が若干違うので)などタンパクによっていろいろ使われています。 それとプロトコールできがついたのは可溶化には1%TRITONはいるかもしれませんがIP後の洗いにはそんなに必要ないかもしれませんね。 その他塩濃度やpHで変わる可能性があります。特に疎水結合を強めるには高い塩濃度がいいですし、イオン結合を強めるには低い塩濃度の方が有利です。金属の関与を考えてEDTAを抜くとか、、 結局は試行錯誤なんですけどね、、、 あとブルーネイティブなどネイティブな電気えいどうも選択肢だと思います。 テクニカルに走るなら、蛍光たんぱく質をまくの同じ側に突き出るようにしてFRETなんていう方法もありかもしれません。 結合していると考える根拠は何でしょうか、、、

弱い結合の膜タンパク質複合体におけるIP 削除/引用 No.1930-1 - 2008/09/10 (水) 16:15:18 - chromatin 現在、ものすごくゆるく集合した膜タンパク質複合体（クラスター化）と結合するタンパク質をIPで落としてくるといった実験を行っています。しかし、今使っている条件では、細胞からタンパク質を抽出する段階で、クラスターが崩壊してしまい、クラスター特異的に結合するようなタンパク質をIPすることができません。 何か、このようなゆるい集合の複合体をIPのステップで崩壊させない方法はないでしょうか？ ちなみに、現在抽出で使っている試薬は、以下のとおりです。 Lysis buffer 50mM Tris-Cl(pH7.9) 5mM EDTA 1% TritonX-100 IP buffer 60mM Trsi-Cl(pH7.9) 6mM EDTA 180mM NaCl 1% TritonX-100 Wash buffer 50mM Tris-Cl(pH7.9) 5mM EDTA 150mM NaCl 1% TritonX-100 アガロースビーズを使っています。 何かいい案がありましたらよろしくお願いします。

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