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(無題) 削除/引用 No.1928-18 - 2008/09/11 (木) 18:02:40 - Vec 1:2と書いたのはモル比です。紛らわしくて申し訳ありませんでした。 S17-1 様 >モル比で1:10ぐらいが良いような印象を持っています。 1：10ですか！わかりました、インサートが全然足りなかったようです。次はもっとインサートの比率を増やしてみようと思います。 今日、自作のエレクトロコンピテントを作りました。形質転換能がどうか分かりませんが、明日、Ligation 16℃ o/nしたものと未処理の14kbのベクター（control)、とpUC19で形質転換をやってみようと思います。 AP 様 ご指導ありがとうございます。本日、ゲルでレーン分けをしてUVを当てないベクターとインサートを切り出しました。これでやってみようと思います。 コンピテントセルに入れるDNAの量は、多いものと少ないもので検討してみようと思います。 コロニーが0ということは、きっと私が何か決定的な事をやらかしているのだろうと思います。明日エレクトロポレーションとケミカルで形質転換を行うので、明後日また報告にまいります。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1928-17 - 2008/09/11 (木) 15:42:08 - AP >100ng程度にまで落とせばよいでしょうか。たくさんＤＮＡを入れると形質転換効率が落ちるとは分かっていても心情的に、入れていい限界まで入れたくなってしまいます。 いうまでもないですが、形質転換効率が落ちるというのは、単位DNA量当たりのコロニー数が減るということであって、入れすぎると総コロニー数が減るということではないです。DNAを増やしていけば総コロニー数は増えていくけれど、ある程度以上では増え幅が小さくなっていくので、たとえば10倍入れても、コロニー数は10倍にはならないということですね。今回のケースでも、DNAの入れすぎたのでうまくいかなかったということは考えにくいです。 >インサートは長波長で最短時間で切り出しました 今回、うまくいかったのがそのせいだといいたいわけではないですが、後々、他の人が読むこともあるかもしれないので、注意を喚起しときます。 長波長なら100%大丈夫というわけではありません。 一応、DNAの吸収波長である短波長（260 nm）ではなく、EtBr自体の吸収波長である長波長（320 nmとか340 nmなど）なら、DNAにダメージを与えないと言われていますが、照射装置や照射時間によります。ランプの波長特性で裾野が短波長側にもかなりきているものもあるでしょうし出力だって違います。手間取って照射時間が長くなってしまうこともあるでしょう。 照射装置を買い換えたときや、あたらしくラボを移ってきた人が、それまでどおりのやり方で長波長を当てて切り出しをして、コロニーが出ない、なんでだろう、となった場面は何度も見ました。UV下で切り出しをして、実用上、問題ないくらいコロニーが出ていたとしても、実はだいぶ効率で損している可能性が高いですし、ちょっと難しいコンストラクトの場合は、その損失が命取りになるかもしれません。 いつでもどこでも、再現性よく切り出しをするなら、切り出しをするDNAには波長にかかわらずUVを当てないのが安全です（最近出ている、青色LEDのイルミネータ、紫外域を全く含まないので、照射しながらのんびり切り出しても大丈夫です）。

(無題) 削除/引用 No.1928-16 - 2008/09/11 (木) 15:09:17 - S17-1 改めて読んで気になったことを少し書かせてください。 >ベクターとインサートを1:2 これはモル比でしょうか？質量比だとモル比が1:28でさすがにインサートが多すぎるような。モル比だと少ないですね。入りにくい時はモル比で1:10ぐらいが良いような印象を持っています。 >ベクター＋insert DNA　total 180ng in 2.5 micro L この溶液がライゲーション反応液のそのものだとするとDNA濃度はかなり高いと思います。DNA濃度が高いと片側がつながっても環化しにくい、と(個人的な経験はありませんが)私の師匠は言っていました。私は平均してその10分の1ぐらいの濃度でやっています。 >16℃、3時間 この条件をやったことが無いのでピンとこないだけかもしれませんが、それよりは室温1-2時間か16℃、o/nがいいと思っています。 形質転換に使うDNAの量は今の条件で最大10ngぐらいにして、200ngどうしても使いたいなら20本のチューブでやった方が何か出てくる可能性が格段に上がるはずですが、結局コンピテントセルがたくさん必要になるのがネックですね。総合すると、エレクトロポレーションの方が簡単、ということかもしれません。 些細なことばかりでこのようなことは関係ない場合が多いのですが「何となくいつもどおり」にやって上手く行かないときはこういうことを気にするといい、というゆるいスタンスです。

(無題) 削除/引用 No.1928-15 - 2008/09/11 (木) 13:36:01 - Vec 先生方のアドバイス、とても参考になります。 自作コンピテントでそれだけのサイズを！私の技術の未熟さが際立ちます。 先日、ゲル抽出を行いベクターにはＵＶを全く当てず（インサートは長波長で最短時間で切り出しました）形質転換をしたもの Ligation時間　3時間 ベクター＋insert DNA　total 180ng in 2.5 micro L Compeent Cell　25 micro L 脱塩なし 2〜3個どころか、全くコロニーが出ませんでした。 なので本日、エレクトロポレーション用の自作コンピテントの作製をはじめるとともに、まだケミカルコンピテントが4反応分ぐらい残っているのでエレクトロコンピテントが出来るまで、ケミカルで出来る事をしたいと思います。 >コンピテントセルに対するプラスミドの量を減らした方がいいかもしれません。 100ng程度にまで落とせばよいでしょうか。たくさんＤＮＡを入れると形質転換効率が落ちるとは分かっていても心情的に、入れていい限界まで入れたくなってしまいます。 Ligation時間をo/nにしました。何か変わればいいのですが…。 この株ではありませんが、ルビジウム法はやった事があり、それなりに形質転換効率も出ました。ルビジウムが高いので、エレクトロコンピテントを作ってみようと思います。 ご指導ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1928-14 - 2008/09/11 (木) 06:48:36 - おお In my experience, I had been inserting 11kbps fragments into 8kbps plasmids. Sometimes the both ends were blunt. But it was working very well with being careful about the potential problems (like making sure the enzymes cut the DNA completely, if there is possibility that you have undigested DNA, considering the way to get rid of it....etc.) I made chemical competent cells by myself with Rubidium (this is old method though), and It was working well. Just I made sure the efficiency (it should be more than 10^7 colonies/ug by general plasmids). You bought the competent cells, so that efficiency should be OK. But you did not get enough efficiency by your plasmid into which you tried to insert the fragment. It is bothering me, somehow. You use a plasmid having different ori from general ones. Perhaps, it made different results. But the plasmid might have nicked for some reason. In this case you should purify the plasmid again. Although I have been talking about chemical competent cells, I have to agree electropolation is an excellent method, so you do not need to stick at chemical competent cells. I hope you will get the plasmids you want. Good luck!

(無題) 削除/引用 No.1928-13 - 2008/09/11 (木) 04:12:21 - S17-1 市販のコンピテントセルは使ったことありませんが、S17-1(lambdapir)で16Kbでの形質転換は普通に出来ました。うちのラボでは20kbを超えるまでは大きいプラスミドとは呼ばれません。ベクターの種類が違うのでなんともいえませんが、10kbに6kbのインサート、XbaI-KpnIサイトです。 未消化のプラスミドに以前、散々痛い目にあったので、ゲル切り出しは必ずやっています。200ngって、そんなに使うの大変だと思うのと、形質転換効率が悪くて目的外のものが優先されるような印象があります。コンピテントセルに対するプラスミドの量を減らした方がいいかもしれません。値段の問題もあるでしょうから、コンピテントセルは自作することをおすすめします。

ありがとうございます！ 削除/引用 No.1928-12 - 2008/09/11 (木) 03:06:36 - Vec >もん様 丁寧なご指導ありがとうございます！ >ピペッティングは禁忌、可能な限り転倒混和かタッピングで作業します。 衝撃的でした。vortexはしませんでしたが、そこまで気を使ってはいなかったです。まだまだ気の使い方が足りなかったと反省しています。 >それでもダメなら、KpnI→Asp718に加えて、SalI→blunt-endとします。 以前脱リン酸化ベクター＋Blunt Endのクローニングで相当手こずった記憶があるので、できれば平滑は避けたいと考えていますが、検討してみます。 >（３）ライゲーション反応は一晩行う。 Blunt Endのクローニングで、全くコロニーが取れなかったものがLigation一晩反応で取れるようになった経験がありますので、これは是非試してみたいと思います。 （４）も使ってみたいのですが、ちょっと特殊な大腸菌でなければ増えないプラスミドなのでこれが使えません。いろいろと形質転換効率のよいものが出ていて、これらが使えたらなあ、と思いますが残念です。１０−２０kbをケミカルコンピテントでクローニングされているのでしょうか。実際に１０−２０kbをクローニングされているということで、とても説得力があり、勇気づけられます。 いろいろとご教授ありがとうございました。 また結果のご報告にあがります。

ひと段落されちゃった後ですみません。 削除/引用 No.1928-11 - 2008/09/11 (木) 01:19:08 - もん 普段10-20 Kbのベクター構築をやっています。 14kbのベクターに1kbのインサート入れるのにKpnIとSalIとは、なんとなくイヤな組み合わせだな、と思いました。 以下、私が構築する場合ですが、 （１）KpnIに代えてAsp718を使う。 KpnIの場合、切れ難い配列がある、失活し易い、切断できても配列によってはライゲーションし難い（トポロジーの問題？）といった印象があるので、不安のある工程では認識配列が同一で5’突出末端になるAsp718を使います。 それでもダメなら、KpnI→Asp718に加えて、SalI→blunt-endとします。 （２）ベクターはゲル抽出する。 痕跡量の未消化のベクターを排除するため、ゲル抽を必ず行います。 ベクター側は制限酵素反応後、BAP処理してそのまま電気泳動（この間フェノクロ処理は一切行いません）。ゲルを切り出す際には長波長（365 nm）のUVを照射します。 ゲル抽出では、ボルテックスとピペッティングは禁忌、可能な限り転倒混和かタッピングで作業します。 （３）ライゲーション反応は一晩行う。 最近のライゲーション液の説明書では長時間反応を行ってもイミがないような記述がありますが、個人的にはそうでもないという気がします・・・おまじないみたいなもんですね。 （４）不安定配列用のコンピテントセルを使う。 例えばInvirogen社のStbl2など。 本来はリピート配列など脱落し易い配列のクローニングの用途のものですが、長鎖のクローニングや配列トポロジーが怪しげ（大して大きな配列でもないのにクローニング不能orコロニーが全く出ないorコロニー形態が異常）な場合にも効果を発揮します。 ＞制限酵素消化後インサートの方はゲル切り出しを行ってその時に、ＳＡＰ処理を行ったベクターを、QIAEXIIのゲル溶解中の溶液にベクター消化産物も一緒にチューブに放り込もうと思います。 インサートとベクターは別々に精製なさった方がいいと思います。 実際にVecさんのコンストラクトを触っているわけではないので的外れかもしれませんが、何かの参考になれば幸いです。

ご指導ありがとうございます 削除/引用 No.1928-10 - 2008/09/10 (水) 19:59:56 - Vec 細やかなご指導ありがとうございました。 エレクトロコンピテントが簡単に作れるとお聞きし、光が見えてまいりました。 本日、ＵＶに細心の注意を払ってライゲーション産物を作りました。これで一度だけ形質転換を行ってみて、それでもコロニーが出ないようでしたらエレクトロコンピテントの自作にうつりたいと思います。 また、結果をご報告にあがります。早く解決済みマークを押したいです。 先生方、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1928-9 - 2008/09/10 (水) 18:18:07 - AP >エレクトロコンピテントを自作すべきでしょうか…。エレクトロコンピテントを作ったことがないので自信がありませんが、あまり神経質にならず簡単に作れるものでしょうか ケミカル、とくにInoue法なんかよりずっと簡単です。 市販品があったとしても買うのが馬鹿らしいくらい。 プロトコールは装置の説明書にもあると思いますが、 OD600=0.5 (<1.0なら、厳密でなくていい）まで普通に増やした菌を、低速遠心で集菌、氷温で冷やした純水に再懸濁、集菌を繰り返して洗い、イオン強度を下げます。培養体積と同じか1/2位の純水から始めて、一回ごとに体積を半分に減らしながら2〜3回も洗えばいいでしょう。最終的には3x10^10 cells/mLの濃度で10% glycerolで懸濁、一回で使い切る量で（transformatio 一回で40-50 uL）分注し、急速凍結して-80度で保存です。 ケミカルだと、10 kbを超えるあたりから急激に形質転換効率が落ちますが、エレクロトロポレーションは大きなプラスミドに強いです。Ligation産物はエタノール沈澱して純水に溶き直すなどしてイオン強度を下げたものを使ってください。

理解しました！ 削除/引用 No.1928-8 - 2008/09/10 (水) 17:54:36 - Vec >UVでチミジンダイマーができると、RecAのホストでは複製が止まってしまいます。おそらく、一分子のプラスミドのどこでも、一箇所でもチミジンダイマーが生じると、組換え修復の中間体の状態で止まってしまうので、プラスミドは生理活性を失ってしまうのだと思います。 ご教授、ありがとうございます。当方が使っておりますプラスミドは、調べてみると確かにRecAでした。UVのダメージがいかに効率に影響を及ぼすかを理解しました。以後、細心の注意を払います。 >ケミカルじゃ絶対無理というわけではないサイズだと思いますが、できれば、エレクトロポレーションを使うといいと思います。 私が使っております大腸菌は、（調べ方が足りないのかもしれませんが）ケミカルコンピテントしか売っていないようなのです。エレクトロポレーションの装置はあります。エレクトロコンピテントを自作すべきでしょうか…。エレクトロコンピテントを作ったことがないので自信がありませんが、あまり神経質にならず簡単に作れるものでしょうか。色々と質問ばかり申し訳ありません。 大きなプラスミドを扱ったことがないので苦戦しております。

(無題) 削除/引用 No.1928-7 - 2008/09/10 (水) 15:06:56 - AP UVでチミジンダイマーができると、RecAのホストでは複製が止まってしまいます。おそらく、一分子のプラスミドのどこでも、一箇所でもチミジンダイマーが生じると、組換え修復の中間体の状態で止まってしまうので、プラスミドは生理活性を失ってしまうのだと思います。 DNAが長いほど、分子内のどこかにダイマーができる確率は高くなるので、UVにたいする感受性は高くなるのでしょう。 でも、切り出しの時にDNA全部にUVを当てる必要はないわけで、位置決めをするレーンを分けるなど工夫すればUV使用は全く問題ないです。 >ポジティブコントロールとして20microLのコンピテントセルに200ngのベクター（14kb)を形質転換すると、プレートに500〜600個のコロニーが出ます（これも少ないのではないかと思っているのですが）。 ケミカルじゃ絶対無理というわけではないサイズだと思いますが、できれば、エレクトロポレーションを使うといいと思います。ホストの調製もケミカルよりはるかに簡単ですし、保存も利きます。装置を自前で持っていなくても、どこかで借りられませんか？ コントロールとして使ったのは、多分、大腸菌から精製したcccだと思いますが、Ligation産物はOCのはずですね。電気泳動でも移動度が段違いに小さいように、OCはガタイが大きいので同じ効率で取り込まれるとは限らないと思うのです。

ご指導ありがとうございます！ 削除/引用 No.1928-6 - 2008/09/10 (水) 14:08:45 - Vec 色々とご指導ありがとうございます！ r6k oriのプラスミドです。 確かに、SalIは切れにくいという印象がありますが、 KpnI-SalI間は20bp以上離れています。 ベクターのKpnI-SalI間に、第三に切断できそうなサイトはありません（インサートに存在する配列なので使えないという意味で）。 また、インサートにはXhoI配列が入っているので、KpnI-SalIでしか切断できません。 プレートに出てきた2〜3個のコロニーの中に、目的のものはありませんでした…。 バックグラウンドのコロニーですら2〜3個しか取れないことからも、形質転換効率とＵＶに問題があるような気がしてまいりました。（とはいえ、ＵＶ照射によって全くコロニーが取れなくなるほど敏感なものなのかと考えると、まだ何か見落としている点がありそうです…） pUC19ではプレート一面を覆いつくすほどびっしりコロニーが出ます。 皆様のご指摘から、今回はサイズが大きいため形質転換効率が悪いということも問題ですが、それは仕方がないとして、ＵＶも当てないという方向で考えています。 制限酵素消化後インサートの方はゲル切り出しを行ってその時に、ＳＡＰ処理を行ったベクターを、QIAEXIIのゲル溶解中の溶液にベクター消化産物も一緒にチューブに放り込もうと思います。QIAEXIIは40bp以下のフラグメントを回収しませんので、ベクターの方のKpnI-SalI産物はビーズに結合しないと思います。ベクターとインサートライゲーション後、形質転換というふうに考えております。 大腸菌が特殊なので、あまり失敗するとコストがかさみ自作しようかと考えていますが、野島法などで自作しても大丈夫でしょうか。 早くスタックから抜け出したいです。

(無題) 削除/引用 No.1928-5 - 2008/09/10 (水) 13:05:31 - おお > インサートはKpnI/SalIフラグメントでしょうか、、、 > インサートがKpnI/XhoIでしたら、ライゲーション後SalI処理(インサートにSalIがないのが条件)でセルフのライゲーションや切れ残ったインタクトのままののコロニーを減らすことができます。 あ、マルチクローニングサイトのKpnI/SalIサイトの間になにか違う制限酵素認識部位があるなら、インサートが切れないという条件でそれを使っても良いですね。

(無題) 削除/引用 No.1928-4 - 2008/09/10 (水) 12:57:41 - おお DNADNAが十分よういできるなら(といっても1ugもあれば十分ですが)メチレンブルーでDNAを染めてもいいかと思います。そうするとUVをあてる必要はありませんから

(無題) 削除/引用 No.1928-3 - 2008/09/10 (水) 12:54:46 - おお >[Re:1] Vecさんは書きました : > クローニングでの質問です。よろしくお願いいたします。 > 14kbのベクターに1kbのインサートを入れようとしています。 > カナマイシン耐性。大腸菌はPIRを要求するもので、ケミカルコンピテントです。 > ポジティブコントロールとして20microLのコンピテントセルに200ngのベクター（14kb)を形質転換すると、プレートに500〜600個のコロニーが出ます（これも少ないのではないかと思っているのですが）。 r6k oriのプラスミドでしょうか。 通常200ngその数は少なすぎますが、１度3-6kbpsのインタクトの通常のプラスミドを入れて(その大腸菌で可能かどうか分かりませんが)効率を見てみた方がいいです。コンストラクトを作るのだったら1ugあたり10^7位のコロニーが出るものを使いたいものです。r6k oriのプラスミドでコンストラクトを組んでいるのならちょっと事情が違うかもしれませんが、、、、 > KpnI/SalIで切断後、電気泳動してバンドを切り出し、ベクターとインサートを1:2でライゲーションしました（Total 200ng)。16℃、3時間です。これをすべて形質転換しました。しかし、コロニーが2〜3個しか出ません。 えっと、その2ー3個の中に欲しいプラスミドはありませんか?過程が何だかんだといっても結果往来ですし、、、 > ＵＶはできるだけ当てないように切り出していますが、過去ログを読みますと、ＵＶの影響が指摘されていましたので、ベクターの方は電気泳動をしない方がよいのかとも考えていますが…。（その場合は、制限酵素処理後フェノクロでの精製でよいのでしょうか） 電気えいどうをしないのであれば、ベクターを脱燐酸化してください。あと切れ残りがなるべく内容に十分に切る必要があります。 インサートはKpnI/SalIフラグメントでしょうか、、、 インサートがKpnI/XhoIでしたら、ライゲーション後SalI処理(インサートにSalIがないのが条件)でセルフのライゲーションや切れ残ったインタクトのままののコロニーを減らすことができます。 さらにベクターから切り出させたKpn/Salの小さなフラグメントが邪魔しないように60ー70度に温めて急冷してからライゲーション反応溶液に入れる手もあります。

(無題) 削除/引用 No.1928-2 - 2008/09/10 (水) 11:47:12 - 現実逃避 超基本ですが、ベクター側とサンプル側のSalIとKpnIは切れていますか。 少なくともベクターは別々に切ってみて、ちゃんと切断されることを 確認されてますか。 NEBカタログの資料によると、SalIは少し切れにくいのかなぁ？という 印象を持ちます。 また、ベクターのSalIとKpnIの距離が近すぎるとか、ないですか。 以前、位置がすぐ隣どうしで切ろうとした入りたて後輩がいました。 UVあてすぎは良くないです。 市販のキットだと、短い断片は回収されない（されにくい？）ものもあります （キット全部がそうかは知らない）。 SalIとKpnIで切断される長さが、回収されない長さだと分かれば キット精製ですませます。 泳動切り出しは収量が稼げないし面倒なのであまりスキではありません。 もちろん必要に応じてやりますが、鎖長が長ければ長いほど UVはかなり気をつかってやります。 大腸菌株も普通じゃなさそうですし、色々問題が予想される場合 私なら別のクローニング汎用ベクターにクローニングしてから サブクロします。

大きなサイズのベクターのクローニング 削除/引用 No.1928-1 - 2008/09/10 (水) 10:57:35 - Vec クローニングでの質問です。よろしくお願いいたします。 14kbのベクターに1kbのインサートを入れようとしています。 カナマイシン耐性。大腸菌はPIRを要求するもので、ケミカルコンピテントです。 ポジティブコントロールとして20microLのコンピテントセルに200ngのベクター（14kb)を形質転換すると、プレートに500〜600個のコロニーが出ます（これも少ないのではないかと思っているのですが）。 KpnI/SalIで切断後、電気泳動してバンドを切り出し、ベクターとインサートを1:2でライゲーションしました（Total 200ng)。16℃、3時間です。これをすべて形質転換しました。しかし、コロニーが2〜3個しか出ません。 ＵＶはできるだけ当てないように切り出していますが、過去ログを読みますと、ＵＶの影響が指摘されていましたので、ベクターの方は電気泳動をしない方がよいのかとも考えていますが…。（その場合は、制限酵素処理後フェノクロでの精製でよいのでしょうか） その他、何かお気づきの点があればご教授いただければと存じます。

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