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Type I enzyme 削除/引用 No.192-5 - 2007/09/16 (日) 09:21:41 - ats ベクターの組み込み用制限酵素部位がインサート内に存在するするため通常ではうまくいかない場合、BsaI(GGTCTCn/nnnn）などのType I enzymeの認識部位をprimerに仕込みインサートに付加する方法もありますよ。この場合(n)/nnnnを組み込み用制限酵素部位とmatchさせます。 ただし、Type I enzymeにはAarIのように認識部位が2つないと切断効率が低いものがあるので注意が必要です。

ご返事どうもありがとうございます 削除/引用 No.192-4 - 2007/09/16 (日) 01:35:41 - 木 ぽーさん、mugimakiさん、ご返事どうもありがとうございます。 わたしと同じ疑問をもった人がいることを知って、ちょっとほっとしました。 そうですか、silent mutation でも発現に影響するというペーパーもあるのですね。 しかし、一方で、transient overexpressionならほとんど影響ないような気もするし（transfection方法の違いの方が影響大きい気が）、SiRNAなどのノックダウンでのレスキューはルーチンで塩基置換するし、まあ、別にsilentなら許してやってもいいような気もします。。。 今回は結局、mutationなしで非常にややこしいコンストラクションと、mutation入れて非常に簡便なコンストラクションの両方をすることにしました。タグの部位をN末とC末で変えるので、無駄骨にはならないでしょう。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.192-3 - 2007/09/14 (金) 11:36:33 - ぽー アミノ酸置換を伴わない変異でも タンパクの機能・発現に影響を与えるって言う報告は何本かあります Human Catechol-O-Methyltransferase Haplotypes Modulate Protein Expression by Altering mRNA Secondary Structure Science 22 December 2006:Vol. 314. no. 5807, pp. 1930 - 1933 A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity Science 26 January 2007:Vol. 315. no. 5811, pp. 525 - 528 全てのケースで成り立つとは思えませんが、 心配ならmugimakiさんのおっしゃってるように 他の制限酵素を探した方が安心できると思います。

silent mutation 削除/引用 No.192-2 - 2007/09/14 (金) 09:47:50 - mugimaki 制限酵素カット部位をアミノ酸置換のないように潰すということは 要するにsilent mutationにするということですよね。 私は遺伝子発現vectorをいくつか作っていますが、 クローニングの際にPCRエラーでmutationになってしまう事があります。 その際にナンセンス、ミスセンスはさておきサイレントの場合、 どうするかということになります。 木さんが感じておられるように肯定派・否定派色々居ると思いますが、 うちではどうしてもという場合（SNPかもしれないとか）以外は極力 避けております。 というのもsilent mutationが入ったvectorと配列通りのvectorでの 蛋白発現量が異なるというdataがあるからです。 （どのpaperかは忘れました。ごめんなさい） というわけで木さんのよう場合、制限酵素cut siteに苦労しますが、 新たなカット部位をつけることやイソシゾマー、結合可能な酵素などを 見つけ、cut siteを潰さなくてもいいようにして対応しています。 CDSでないところは勿論潰したりすることもあります。 miRNAのtarget siteに当たれば勿論影響はあるのでしょうけれど 取り敢えずそういうことをしていると頭に置いて実験を進めています。 参考になれば幸いです。

PCRによる塩基置換について 削除/引用 No.192-1 - 2007/09/13 (木) 14:45:01 - 木 初めまして。 非常に初歩的な質問をさせていただきます。 DNA上の、ある制限酵素サイトをどうしても潰したいのです。 その場合、アミノ酸が変わらないようにPCRで塩基置換してもいいのでしょうか。 こういうことは結構ルーチンでされるのですか。 私の周りでは、そういうことをしてもいい派と気持ち悪い派がいます。 肯定派は、アミノ酸が変わらないのだから、ということです。 否定派は、転写制御などに影響がでるかもしれない、ということです。 ご意見どうぞ宜しくお願い致します。

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