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(無題) 削除/引用 No.1918-12 - 2008/09/10 (水) 16:47:05 - とと なるほど。 それは良い方法ですね！

(無題) 削除/引用 No.1918-11 - 2008/09/10 (水) 14:49:58 - in situ PCRプロダクトをそのままシークエンスするのではなく、何らかのベクターに一度クローニングしてからベクターの一部に対するプライマーでシークエンスするというのはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1918-10 - 2008/09/10 (水) 14:44:23 - とと シークエンスの結果が出たのですがやはり、ノイズが多いので 読めません。非特異的な増幅は精製で除去できないことを考えると nested PCRでゲル切り出して、さらに内側プライマーでシークエンスする方法がよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1918-9 - 2008/09/09 (火) 16:06:24 - とと ありがとうございます。 ゲル切り出し→MonoFas精製→内側プライマーでシークエンス反応 でやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1918-8 - 2008/09/09 (火) 15:09:45 - AP たぶん、PCR産物がheterogenousで、複数のシークエンスが重なっているのでしょう。カラムだとprimer dimerや非特異的なPCR産物は除けないので、電気泳動からの切り出しをまず試してみることですね。 また、電気泳動でシングルバンドに見えても、サイズが非常に近い、複数の産物が含まれている可能性もありますので、PCRのプライマーを変えるとか、nested PCRをするとか、シークエンスプライマーをPCRプライマーより内側に寄せるとかするといいかもしれません。 どんなタイプのシークエンサーを使っているかわかりませんが、この近年に販売されているキャピラリーシークエンサーだと、びっくりするくらい感度がよいので、鋳型量がかなり少なくても、たとえば電気泳動でPCR産物がはっきり見えないくらいでも、きれいに読めたりします。反面、一見きれいに見えるPCR産物でも、気づかなかった非特異的なPCR産物があるせいか、ノイズが高くて読み取り困難ということもあります。

(無題) 削除/引用 No.1918-7 - 2008/09/09 (火) 14:00:31 - とと 精製後にはやはりバンドはかなり薄くなっておりますので、ロスしている状態です。なかなか難しいですね。

(無題) 削除/引用 No.1918-6 - 2008/09/09 (火) 11:57:22 - student >[Re:3] ととさんは書きました : > ありがとうございます。 > ノイズは全体的に高いのでゲルを切りだしてやってみます。 > > シークエンスの際のDNA濃度は濃すぎても薄すぎても問題になるのでしょうか？ DNA濃度が高い場合は、シークエンスを読む分には問題ないですが、キャピラリーが早く悪くなると聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1918-5 - 2008/09/09 (火) 11:20:42 - おお >[Re:3] ととさんは書きました : > ありがとうございます。 > ノイズは全体的に高いのでゲルを切りだしてやってみます。 > > シークエンスの際のDNA濃度は濃すぎても薄すぎても問題になるのでしょうか？ 薄いのはノイズが目立ってくる原因になります。プライマーが非常に優れたものであれば、プラスミドとかシンプルな系ではきれいに読めることもありますが、ゲノムからのPCRとかだとそうは行かないでしょう。 濃いのはあまり問題にならないと経験的には思っています。ながい物を読む時は多すぎると、前半で色素を消費してしまって後半読みにくくなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1918-4 - 2008/09/09 (火) 11:08:23 - とおりすがり もう少し情報が欲しいですね... あるテンプレートだけでノイズが大きいのか 全てのテンプレートでそうなのか とか 後者だとすると、seqの反応そのものが余りうまくいっていないような気がします。原因としてはテンプレートが少なすぎるか、逆に多すぎるか、かな？ 精製後のテンプレートは電気泳動などで確認できますか？ フィルターと使った精製キットとかですと、吸着して無くなってしまうことがありました。

(無題) 削除/引用 No.1918-3 - 2008/09/09 (火) 11:07:36 - とと ありがとうございます。 ノイズは全体的に高いのでゲルを切りだしてやってみます。 シークエンスの際のDNA濃度は濃すぎても薄すぎても問題になるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1918-2 - 2008/09/09 (火) 10:25:58 - おお 局所的にバックグランドが上がるようでしたら、シーケンス反応後の精製が問題かもしれません。 そうでない場合は多分ゲルから切り出してないみたいなので、ゲルから切り出してシーケンスする。 PCRの条件を厳しくしてバックグランドの原因となる副産物をさげるなど でしょうか、、、

DNAシークエンスのノイズ 削除/引用 No.1918-1 - 2008/09/09 (火) 10:04:18 - とと 臨床サンプルからPCRで増幅後電気泳動で目的バンドを確認したのち PCR産物をそのままMonoFas DNA精製キットで精製後、シークエンスにかけていますがノイズが大きく、配列が読めなくて困っております。 他の精製方法で良い方法があればどなたか御教授ください！

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