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Re: 削除/引用 No.1916-12 - 2008/09/12 (金) 09:43:02 - real-time PCR

皆さんありがとうございました。 削除/引用 No.1916-11 - 2008/09/11 (木) 09:14:21 - real-time PCR mom-aさん、UCさん、カナマイシンさんありがとうございました。皆様の意見はすごく参考になりました。皆様の貴重なお時間を割いてたくさんの意見を頂きありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1916-10 - 2008/09/10 (水) 21:20:14 - カナマイシン 私の場合は、real-time PCRに持っていく前に 予備実験（プライマーの出来・不出来チェック）として ノーマルPCR→アガロースゲル電気泳動を行っています。 プライマー、増幅条件はreal-time PCRと同じにし、 酵素もできるだけ近づけます （例えばreal-time PCR用にSYBR with Ex Taqを用いるのなら予備実験はEx Taq）。 テンプレートにはゲノムを用いています。 この予備実験の結果で、目的バンドの大きさにきれいな単一バンドが得られるならOKとし、 増幅無し／複数バンドなら条件変更（たいていプライマー頼み直し）とします。 単一バンド＋薄いノンスペが１本、くらいなら経験上大丈夫なことが多いです。 もちろん通常のサーマルサイクラーとreal-time PCRとでは 大いに条件が異なるのは承知の上でやってます。 実際上記の判別法で失敗したことは（そんなにたくさんやってないですが）皆無です。 ただ…当方は原核生物使いなので予備実験テンプレートにゲノムを使えますが、 真核だと、イントロンを避けないと予備実験テンプレートとしてゲノムを使えませんね。

Re: 削除/引用 No.1916-9 - 2008/09/10 (水) 19:21:29 - UC こんにちは。 ・SYBR Greenは、ABIのSYBR Green Master Mixを使っています。機器は、同じくABIのApplied Biosystems 7000 Real-Time PCR System（ちょい古め）です。 ・Primer3でのTm値設定は60℃でデフォルトのまま、弄るのは長さだけです。 ・PCRの条件は、Annealing/extensionに関してはデフォルトの60℃/60secでワークする場合が殆どですが、融解曲線が綺麗でないときは、62℃/30secにすると、まるで別のプライマーを使ったかのごとく融解曲線が改善されることが多いです。プライマーの理論Tm値は気にしません。 ・既に書かれていますが、「融解曲線で複数のピークがあって、再現性もマチマチ」というのは大いに問題ありなので、ある程度条件設定を弄っても改善されないならば、新たにプライマーを注文するのが良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1916-8 - 2008/09/10 (水) 10:18:50 - mom-a >その結果、R2の値は0.99であっても増幅効率を計算すると、80-120％の範囲内にありません。このときは、融解曲線をみると、複数のピークがみられます。しかし、これは実験するたびに変わり増幅効率がいいときもあります（同じプライマーでやったとき）。このときの融解曲線は、一つのきれいなピークがでます。 融解曲線に複数のピークがみられる状態では正しい定量ができていません。同じ条件でもピークが一つの場合があるということは、条件が微妙でサンプルの精製度や目的遺伝子の量その他ちょっとした状況で上手く行ったりいかなかったりしているのかもしれません。PCRの条件検討をしなおして、安定して測定できる条件をみつけたほうがいいでしょう。増えれば良い、というPCRではありませんから、私の場合は、アニーリング温度を検討してあまりいい条件がみつからないようならプライマーを変えてしまいます。 インターナルコントロールと同じ条件ということには拘らなくて宜しいかと思います。融解曲線のピークの方に拘ってください。アニーリング温度は理論上のTm値を中心に検討を始めますが、検討結果をみて上手く行っている温度を採用します。 あと、個人的な好みかもしれませんが、検量線はできれば5点とるようにしています。特にcDNAで検量線を引く場合、低濃度側で直線が寝てきてしまっていないかどうか、3点では確認することができないので。 ＞各会社の試薬によって、プライマーダイマーや非特異的増幅を抑えたりすることが違ったりするのでしょうか？ 試薬によって違うことは確かにあるようですが、プライマーとの相性？もあり、常にこのメーカーがベスト、というわけでもないようです。

UCさんありがとうございます。 削除/引用 No.1916-7 - 2008/09/10 (水) 09:20:30 - real-time PCR UCさんは60℃のアニーリング温度でリアルタイムPCRをしているということですが、Primer3でのTm値設定は、やはり60℃でしょうか？UCさんが使用しているSYBR Greenの試薬はどこの会社で、なんという製品か教えて頂ければ嬉しいです。 私はTotal RNAを900ng使ってcDNAを合成し、スタンダードサンプルを1x，10x，25xで希釈し検量線を引いています。その結果、R2の値は0.99であっても増幅効率を計算すると、80-120％の範囲内にありません。このときは、融解曲線をみると、複数のピークがみられます。しかし、これは実験するたびに変わり増幅効率がいいときもあります（同じプライマーでやったとき）。このときの融解曲線は、一つのきれいなピークがでます。 このことから、�@cDNAに阻害物質が入っているか、�AリアルタイムPCR初心者のため腕が悪いか、�Bプライマーが悪いの3つのことを考えました。�@ですが、同じcDNAサンプルを用いてインターナルコントロール用のプライマーを使用すると、毎回、増幅効率が80-120％の範囲内にあるので、多分、cDNAサンプルに阻害物質が入っているとは考えられません。�Aは、リアルタイムPCR初心者のため腕ではないと言い切れません。�Bもわかりませんが、皆さんの意見をお聞きして、�Bが違うなら自分の腕を疑うことができると思いました。 あと、アニーリング温度にこだわっていた理由は、目的の遺伝子のプライマーとインターナルコントロールのプライマーのアニーリング温度を同じに設定して、一緒にリアルタイムPCRを行いたかったからです。 もう一つ質問ですが、各会社の試薬によって、プライマーダイマーや非特異的増幅を抑えたりすることが違ったりするのでしょうか？もし、おすすめの試薬があれば教えて頂ければ嬉しいです。よろしくお願い致します。

Re: 削除/引用 No.1916-6 - 2008/09/09 (火) 21:19:55 - UC 　こんにちは。タカラバイオのリアルタイムPCR実験ガイドの指示がどうかは知りませんが、Primer3でデザインするのであれば、Tm値はdefaultの60度で決め打ちで良いのではないでしょうか。ここのサイトで弄るパラメータは、「Product Size Ranges」ぐらいで、ここを100-180あたりに設定してます。個人的には、アニーリング温度は60℃の場合が殆どですが、プライマーによっては62℃で走らせてます。条件設定で、理論上のTm値が何度だから･･･というのは特に考えたことないです。 リアルタイムPCRでプロダクトサイズが150-300bpというのは大きすぎる気がするのですが、こうしないといけない理由があるのでしょうか。 後、別の方が言及していますが、何を持って「増幅効率が悪い」としているのでしょうか。 >インターナルコントロールと定量したい遺伝子を同時にリアルタイムPCRで増幅していますか 　これは、実験の規模(デザイン)によりますね。同じプレート上にreferenceの遺伝子があるのが理想ですが、サンプル数が多いと、そうできない場合も出てきます。この場合は、キャリブレータとして各プレートで共通のcDNAを用意したりしてます。

情報が足りなくてすみません。 削除/引用 No.1916-5 - 2008/09/09 (火) 09:27:27 - real-time+PCR Finnzyme社のSYBR Greenで機器はRotor-Geneです。Product sizeは、80-150，150-300ぐらいです。パラメーターは、Tm値以外、すべてタカラバイオのリアルタイムPCR実験ガイドに従っています。ちょっと疑問に思ったのですが、皆様は、インターナルコントロールと定量したい遺伝子を同時にリアルタイムPCRで増幅していますか？私は、一緒に増幅しないといけないと思っていてインターナルコントロールと定量したい遺伝子のプライマーのアニーリング温度を同じにしたいと思っていたのですが・・・。

Re: 削除/引用 No.1916-4 - 2008/09/09 (火) 00:42:03 - UC もう少し具体的に、パラメータを書くとレスも付きやすいと思います。どれくらいのproductサイズを指定しているのか、系はSYBR Greenを使っているとか、機器はABIとかRocheとか。 　個人的な感触として、SYBR Green系ABIとPrimer3の相性は良いように思います。Product size:100-150bpぐらいで。

(無題) 削除/引用 No.1916-3 - 2008/09/09 (火) 00:36:48 - おお >[Re:1] real-time PCRさんは書きました : > 今、Primer3でreal-time PCR用のプライマーの設計を行っており、設計したプライマーを使用してリアルタイムPCRを行うと、検量線は引けるけど増幅効率が悪いということが多いです。皆様は、どのようなソフトでプライマーを設計しているでしょうか？もし、他の無償のソフトがあれば教えてください。あと、Primer3で設計したときに出てくるTm値とアニーリング温度の違いはどのくらいあるのでしょうか？リアルタイムPCR初心者で、変なことを書いているかもしれませんが皆さん教えてください。よろしくおねがいします。 You might have long PCR products. To get ideal efficiency the size should be between 100 and 150 bps. In addition, you might want to try lower annealing Temp and other conditions. PCR is not logical as you think. Finally, how bad efficiency do you get? If you show those, you would get general information. By the way, I would not use any software, but at least I blast the sequences I design.

(無題) 削除/引用 No.1916-2 - 2008/09/08 (月) 22:16:15 - しちみ Primer3はデファクトスタンダードになってるので、他に探しても基本的には同じものではないでしょうか。 熱力学的な計算をやってくれるだけでしょうから。 違いと言えば配列DBで相同性検索をしてくれるくらいでしょうか。 質問の詳細が不明ですが、パラメーター設定はどんな場合でも重要なので注意してください。 検索したらこんな親切なサイトが見つかりました。 プライマー設計の実際を（なんと！）動画で説明してくれます。 http://togotv.dbcls.jp/20070824.html それから、どんなプライマーでも条件の最適化は必要です。 アニーリング温度と伸長時間くらいは検討して損はありません。

プライマー作製 削除/引用 No.1916-1 - 2008/09/08 (月) 20:12:46 - real-time PCR 今、Primer3でreal-time PCR用のプライマーの設計を行っており、設計したプライマーを使用してリアルタイムPCRを行うと、検量線は引けるけど増幅効率が悪いということが多いです。皆様は、どのようなソフトでプライマーを設計しているでしょうか？もし、他の無償のソフトがあれば教えてください。あと、Primer3で設計したときに出てくるTm値とアニーリング温度の違いはどのくらいあるのでしょうか？リアルタイムPCR初心者で、変なことを書いているかもしれませんが皆さん教えてください。よろしくおねがいします。

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