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(無題) 削除/引用 No.1912-6 - 2008/09/08 (月) 17:09:30 - P ＞studentさん おっしゃられる通りですね。 タンパク質の性質を考慮してアッセイ系を考えてみます。 ＞奴隷さん なるほど、参考になります。 私もAla,Glu,Aspの変異体を作製してみて発現を見てみることにします。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.1912-5 - 2008/09/08 (月) 15:36:19 - 奴隷 リン酸化による活性の変化を見るための一般的な手法は無いと思います。 私の扱っていた分子の一例は、刺激に応答してリン酸化され活性化されるプロテインキナーゼだったので、リン酸化部位のSerをAla、Asu、Gluにそれぞれ置換した変異体を作製し、それを細胞に発現させて基質分子のリン酸化レベルを確認するとともに、タグを利用して精製したものを用いてin vitroキナーゼアッセイを行いました。活性はいずれのアッセイでも、 刺激後のWT＞＞Glu変異体＞Asu変異体＞＞刺激無しのWT＞Ala変異体 でした。

(無題) 削除/引用 No.1912-4 - 2008/09/08 (月) 15:32:59 - student > ちなみに、リン酸化あるいは脱リン酸化によるタンパク質の活性を測定することがネックになると思うのですが、この点何かよい手法はあるでしょうか？ > タンパク質によりけりだとは思うのですが・・・。 おっしゃっている通りタンパク質によりけりです。 キナーゼであれば、下流のタンパク質のリン酸化、 なにかの酵素であれば、酵素活性。 良い方法と漠然と言われても、どういうタンパク質かわからないとなんとも言えません。

(無題) 削除/引用 No.1912-3 - 2008/09/08 (月) 15:19:28 - P ＞奴隷さん なるほど、勉強になります。 やはり実際に作製してみて、発現及びその挙動をWBや蛍光抗体法で調べてみる必要がありますね。 ちなみに、リン酸化あるいは脱リン酸化によるタンパク質の活性を測定することがネックになると思うのですが、この点何かよい手法はあるでしょうか？ タンパク質によりけりだとは思うのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.1912-2 - 2008/09/08 (月) 11:34:19 - 奴隷 広く行われています。セリンやスレオニンがリン酸化されると、リン酸基の負のチャージが付加されることになりますが、酸性アミノ酸残基に置換することでそれを真似るというわけです。 ただし、実際にリン酸化型を模した挙動をするかどうかはタンパク質によるのでやってみないとわかりません。また、アスパラギン酸に代えるのとグルタミン酸に代えるのでどちらが有効かもタンパク質によりけりです。活性化型になったといっても、正常なリン酸化型の1/10程度の活性だったということも経験あります。 スレオニンのリン酸化にも同様な扱いは可能ですが、これもタンパク質によりけりでやってみないとわかりません。

リン酸化部位改変 削除/引用 No.1912-1 - 2008/09/08 (月) 11:22:25 - P 大学で研究を進めている学生です。 あるタンパク質の修飾、特にリン酸化修飾について調べているのですが、ある論文を調べていましたらリン酸化部位のセリンをアラニンに置換することによりリン酸化されないタンパク質を発現できる、またセリンをグルタミン酸に置換することにより擬似的なリン酸化タンパク質を発現できるとありました。 これはセリンがリン酸化されるタンパク質には一般的に言えることなのでしょうか？ グルタミン酸に置換することがよくわかりませんでした・・・。 またスレオニンのリン酸化にも同様な変異が可能なのでしょうか？ もし知っている方がいらっしゃいましたら、ご教授していただけたら幸いです。

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