全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

測定方法にもよりますが 削除/引用 No.1909-9 - 2008/09/08 (月) 11:30:59 - mom-a Taq-manかSYBR Greenかとか、Ct値の算出方法にもよりますが、Ct値30から希釈して検量線を描くのは難しいと思います。 希釈倍率が2倍で6点だとCt値30〜36の範囲になるでしょうが、SYBR GreenでCt値35以上というのは、primerにもよりますが精度が悪いです。10倍希釈だとCt値が40を超えますから、定量性は期待できないでしょう。以前、copy数既知の検量線サンプルでお遊びでやってみたところ、計算上1tubeに1copyになる濃度でPCR（SYBER)をかけると、50サイクル回しても2/3は検出されず、1/3はCt値40サイクル前後でした。 templateを多くする、あるいは目的配列を組み込んだプラスミドを使うか、PCRで増幅した産物をtemplateにするとか、もう少し濃度の濃いところから検量線を引いてみて、検出限界を確認されると良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1909-8 - 2008/09/08 (月) 09:37:04 - student 段階希釈したものもduplicate間はばらつ > きがほとんどなく、しかしこれらの増幅曲線が等間隔に並んでいないという > 感じです。このことから、RT反応→PCR反応の過程に問題があるというよりは > スタンダードの希釈に問題があったと解釈したのですが、間違ってるでしょう > か？ > プライマーの増幅効率が悪いのでは？ > 目的としている遺伝子はCt値が30前後と発現が少ないので、template量を増や > してやり直してみたいと思います。 RT-PCRしたあとのcDNAならば30前後でもしょうがないと思います。 GAPDHやactinなどは20なかばだと思います。経験的に。

質問主です。 削除/引用 No.1909-7 - 2008/09/07 (日) 23:19:25 - 円周率 皆様、アドバイスありがとうございます。 ＞検量線が上手く引けないから、検量線を作製しない方法をとるという考え方に疑問を感じませんか？ ＞こんな検量線で定量するなら、PCRをやらない方がましです。 おっしゃること、ごもっともだと思います。実験自体がうまく行ってないのに それで何かものを言おうというのはおかしいと自分でも思います。実験条件 の再検討は必要だと思います。 PCRは検量線用サンプル、測定用サンプル共にduplicateで行っているのですが、duplicate間のばらつきは殆どなく、前にも書いたとおりGAPDHのCt値は 全てのサンプルでほぼ同じでした。段階希釈したものもduplicate間はばらつ きがほとんどなく、しかしこれらの増幅曲線が等間隔に並んでいないという 感じです。このことから、RT反応→PCR反応の過程に問題があるというよりは スタンダードの希釈に問題があったと解釈したのですが、間違ってるでしょう か？ 目的としている遺伝子はCt値が30前後と発現が少ないので、template量を増や してやり直してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1909-6 - 2008/09/07 (日) 16:09:11 - おお >[Re:1] 円周率さんは書きました : > て係数が0.9くらい。こんな検量線で定量するなら、なしでやっても同じかな > と思ってます。係数を改善する方法もあわせてアドバイスいただけると嬉しい > です。 > こんな検量線で定量するなら、PCRをやらない方がましです。 どのようにバラついているのでしょうか、、、それによっても対処方法が違ってくると思いますが。 直線にならないとか、各ポイントでn=3でやるとそれでかなりばらつくとか、、、、、 もともとそんなに発現していなくて、検出困難なレンジで行っているとかいろいろとあると思います。 GAPDHでうまく行くので手技、試薬、機械の問題ではなさそうですが、、 伸長反応の温度をいじるだけでうまく行くかもという気もしますが、、、、、、、、

(無題) 削除/引用 No.1909-5 - 2008/09/07 (日) 16:08:29 - student 検量線を引く場合に使用するテンプレートは十分に濃度の高いものを使用していますでしょうか？ 濃度の薄いサンプルはばらつきが大きくなります。 Ct値が３０以上になるようなテンプレートをさらに希釈して検量線を引く場合はばらつきが大きくなると思います。 目的遺伝子を組み込んであるプラスミドを使用して検量線を引くのがベストです。 それでもばらつく場合はプライマーが良くないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1909-4 - 2008/09/07 (日) 15:21:05 - IRES 検量線を作成しない方法云々よりも、検量線が引けない条件で行っていることが問題ですよ。検量線が引けないということはちゃんと目的遺伝子の増幅量をモニタリングできていないということですよね。そのような条件で行った結果に意味があるのでしょうか。検量線が上手く引けないから、検量線を作製しない方法をとるという考え方に疑問を感じませんか？

(無題) 削除/引用 No.1909-3 - 2008/09/07 (日) 14:46:51 - student もちろん検量線を用いた方法（絶対定量）のほうが正確な値がでます。 しかし検量線なしで行う方法（相対定量）も実際に論文でも扱っているものはあります。しかし相対定量を行う前提としておっしゃっている通り、プライマでの増幅効率が十分によいこと。だいたい８０％以上あればいいと聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1909-2 - 2008/09/07 (日) 12:01:18 - 7878 検量線無しの方法とはddCt法ですね。この方法自体はポピュラーな方法で多くの論文でも採用されてます。ただ仰るとおり，ターゲットとインターナルコントロールの遺伝子間で増幅効率が一致しない場合，ddCt法で比較することはお薦めできません。 ターゲットの検量線が上手く引けないと言うことですが，そもそも検量線も引けないようなプライマーセットを用いてddCt法を行うのはナンセンスです。サンプルの希釈方法やプライマーの再設計などから見直した方がよろしいかと思います。この方法を理解するにはＡＢＩのユーザーブリテンを参考にされるとよろしいと思います。 http://abj.custhelp.com/cgi-bin/abj.cfg/php/enduser/std_adp.php?p_faqid=608&p_created=1106162160&p_sid=YJnc4edj&p_accessibility=0&p_redirect=&p_lva=&p_sp=cF9zcmNoPSZwX3NvcnRfYnk9JnBfZ3JpZHNvcnQ9JnBfcm93X2NudD0xMTAxJnBfcHJvZHM9JnBfY2F0cz0mcF9wdj0mcF9jdj0mcF9zZWFyY2hfdHlwZT1hbnN3ZXJzLnNlYXJjaF9mbmwmcF9wYWdlPTE*&p_li=&p_topview=1

検量線を用いないリアルタイムPCRの定量 削除/引用 No.1909-1 - 2008/09/07 (日) 08:30:46 - 円周率 よろしくお願いします。 最近ある細胞処理による遺伝子発現の変化を調べるため、リアルタイムPCRを ２ステップ法で行っています。定量については本で調べて検量線を作成して やろうと思っていたのですが、検量線を用いない簡潔な方法と言うのを教えて もらい、どうしようか迷っています。 その検量線を用いない方法は、excelにあらかじめ計算式が入っていて、PCRで 出たCt値をcopy and pasteするだけでinternal controlとの発現量の比が ポンと出ると言うものです。式を見ると、PCR１サイクルあたり増幅産物が ２倍になると仮定して計算を行っているようです。 質問ですが、このような方法で得たデータは論文で用いて問題ないのでしょ うか？検量線作成は結構手間がかかりますし、この方法はとても魅力的に 感じるのですが、プライマー間でPCRの増幅効率に差がある場合に問題が生じ るようにも思えます。文献にはデータの解析法を詳しく示したものはあまり ないように思うのですが、実際皆さんは６段階くらいの希釈系列を作って やってますか？ ちなみにcDNAを段階希釈して検量線を作ってみたのですが、ばらつきが大きく て係数が0.9くらい。こんな検量線で定量するなら、なしでやっても同じかな と思ってます。係数を改善する方法もあわせてアドバイスいただけると嬉しい です。 controlにはGAPDHを使っていますが、増幅曲線はきれいに重なっていて、Ct値 もほとんど同じなので、傾向を見るだけなら検量線を使わなくてもできると 思うのですが･･･

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---