ラット心筋切片から細胞質分画のみ抽出してウェスタンを行っています。
細胞質分画とミトコンドリアおよび核などの分画を完全に分離したいのですが、このサイトを含めて様々な方法が書かれていて混乱しています。
手元にある論文には >>>
hearts were excised and flushed with ice-cold homogenization buffer (210 mM mannitol, 70 mM sucrose, 5.0 mM Mops,1 and 1.0 mM EDTA, pH 7.4). The left ventricular free wall was then isolated and
homogenized in 20 ml of homogenization buffer/g of ventricle with a Polytron homogenizer (low setting, 3 s).
とかかれています。
他にもbufferはただのPBS(protease inhibitor入り）でいいという人もいますし、巷では高そうなミトコンドリア抽出キットのようなものもありますよね？自作するならPBSが一番簡単そうなのですが、これで果たしていいんでしょうか？
あと細胞の破砕は、ミトコンドリアを破壊しないためになるべくマイルドにやったほうがいいのは理解できます。ただ、上の論文のようなポリトロンは機械刃でかき回すタイプだと思うのですが、本当にミトコンドリアを破壊してないんでしょうか？サンプルが細胞ではなく塊の心筋切片なので、ある程度ゴリゴリやらないといけないのはわかるんですが・・・。これまでは超音波でやってましたが、さすがにまずそうなので今度このポリトロンを買うかどうか迷っているところです。
すみませんが皆さんの知恵を貸してください。
よろしくお願いします。
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