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PBSの作り方 削除/引用 No.1893-9 - 2008/09/05 (金) 10:20:10 - mom-a ＞PBSは、NaCl：145mMとNaH2PO4：10mMを超純水に溶かしpH 7.4に合わせ これだと、何でpHを合わせたのかわかりませんが、NaClとNaH2PO4だけの組成だとすると、こういう組成のPBSは私は始めて見ました。（Na2HPO4であわせたのだとすると、こういう書き方はヘンです。） syokuhinさんが培養実験に慣れているのかどうかわかりませんが、もう少し状況を詳しく書かれた方が良いと思います。 例えば、回収前の細胞の状態はどうでしたか？がっちり貼りついていたのか、結構浮いているものが多かったのか、変形しているものはいなかったか…増殖させすぎで細胞が弱っていたなら、この時点で何か異常がわかることがあるかもしれません。 使っているdishはコーティングしてありますか？それによって剥がれやすさが全然違いますから、dishあるいは剥がし方を変えることも考えられるかもしれません。 細胞によっては回収時の遠心が強すぎてダメージを受ける場合もあるでしょう。 トリパンブルーが蒸発して濃度がものすごく濃くなっているなんてことはないですか？ syokuhinさんのことではありませんが、培養に慣れていないと思わぬことを起こします。昔学生に教えていた頃、0.5mLのピペットで細胞懸濁液を取ってきて、トリパンブルーで染めてカウントする、というのをやらせたら、細胞が全部真っ青に染まっていてびっくりしました。何かと思ったら、ピペットを念入りに火炎滅菌しすぎて、吸い込んだ細胞が湯だって死んでしまったのでした。

(無題) 削除/引用 No.1893-8 - 2008/09/05 (金) 10:10:37 - IRES PBSは標準のものであれば問題ありません。 RAW264細胞は一応半浮遊型とされていますがかなり接着性の強い細胞です。 ラバーポリスマンで剥がす際にはかなり注意深く行わないと大半の細胞は死んでしまいます。難しいようであればトリプシン/EDTAで剥がすことをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.1893-7 - 2008/09/05 (金) 09:47:50 - ~ >名無しさん 作り方も組成も違うPBSがあります。 >PBSってNa2HPO4とKClとKH2PO4とNaCl決まった量混ぜてつくってpHは合わせなくてもpH7.2~7.4になる そのような調製方法はありますよ。 水和物の数さえ間違えなければ、それなりのpHの範囲にすることが出来るでしょう。 ただ、それがPBSを作製する唯一の方法というわけではありませんし、 カリウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水も見たことがあります(組織染色で使われていました)。 >見るとなんか作り方違うみたいなのですが どのような作り方を見たのか分かりませんが、 pHメーターでpHを調製する 1Na塩と2Na塩の溶液を作って、決まった量比に混ぜる(そしてNaClを足す) x10濃縮液を作って薄める といった方法もあります。 最終的な組成が同じならば、同じ使用目的で使うことが出来ると思いますが、 変更するのならば、一度両者を並べて比較しておいた方が安心でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1893-6 - 2008/09/05 (金) 02:03:28 - おお >[Re:4] うーんさんは書きました : > そりゃあラバーポリスマンではがせば死んじゃうよね。 > > トリプシンで剥がすか、リドカインでかがすか、cold roomで剥がすか… ATCCを見る限り、この細胞はトリプシンを使わずスクレーパーみたいなもので剥がしてけいだいする方法をとるようです。 PBSの代わりにPBS-EDTAを使い念入りに洗ってみてはと思いますが、それでもはがれないならトリプシンも選択肢だとはおもいます。増殖させ過ぎて細胞が弱っている状態で回収しているとか、マイコプラズマがコンタミしているとかいうのもあるかもしれません。 一般的にディシュのメーカーをかえたらうまく行った(細胞の調子がよくなったとか)なんていうケースもチラホラ聞きます。

(無題) 削除/引用 No.1893-5 - 2008/09/04 (木) 22:27:57 - 名無し PBSってNa2HPO4とKClとKH2PO4とNaCl決まった量混ぜてつくってpHは合わせなくてもpH7.2~7.4になると長い間思ってたのですが、見るとなんか作り方違うみたいなのですが最近変わったのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1893-4 - 2008/09/04 (木) 18:23:24 - うーん そりゃあラバーポリスマンではがせば死んじゃうよね。 トリプシンで剥がすか、リドカインでかがすか、cold roomで剥がすか…

(無題) 削除/引用 No.1893-3 - 2008/09/04 (木) 17:30:51 - まっくろん 　RAW264を扱ったことがあります。 　RAWは接着が強いため剥がれにくいです。回収にはトリプシンを用いていました。トリプシン添加（3分-5分、37°C）後、ピペッティングし、細胞を浮遊させ回収していました。ピペッティングは、パスツールピペットで行うとうまくいきました。 　ラバーポリスマンは使ったことがないのですが、スクレーパーみたいなものでしょうか？私が使っていたスクレーパーはIWAKIのものでしたが、それを使ってもうまくいきました。スクレーパーを使うとき、「はがす」というより「dishをなぞる」感じで回収していました。 　わかりにくい文章でごめんなさい。参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.1893-2 - 2008/09/04 (木) 16:57:10 - TF >>ラバーポリスマンで細胞を掻き取り この操作の時に細胞が痛んでしまうのでは？ 接着が弱いならPBS入れた後dishを振って細胞をはがしてみては？ 接着が強いならトリプシンを使用してみたら？ ちなみに、これは継代が目的ですよね？？

細胞が死んでしまう理由 削除/引用 No.1893-1 - 2008/09/04 (木) 16:42:40 - syokuhin 現在、RAW264細胞を使った実験をしています。 実験手順に、『シャーレに貼り付いている細胞をPBSで洗った後、1mlのPBSを新たに加え、ラバーポリスマンで細胞を掻き取り、細胞混濁液をチューブに回収する』という作業があるのですが、チューブに回収後、細胞をトリパンブルーで染色してみると、ほとんどの細胞が染まってしまいます。 いろいろと調べてみたのですが、なぜ細胞が染まってしまうのか（死んでしまうのか）がわかりません。 どなたかアドバイスをお願いします。 ちなみに、PBSは、NaCl：145mMとNaH2PO4：10mMを超純水に溶かしpH 7.4に合わせ、120度20分のオートクレーブにかけて作っています。

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