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(無題) 削除/引用 No.1893-29 - 2008/09/08 (月) 14:37:25 - PBS 質問に書かれているPBSの組成だとカリウムが入ってないですね。ナトリウムとカリウムの細胞内外のバランスは細胞の生存に大変大切ですからカリウム抜きだと細胞にとってあまり良い状態ではないとおもいます。D-PBSやHanks液は単にpHや浸透圧を合わせてというだけでなくその辺の哺乳動物の体液組成も考慮して作られているように思います。どんな本でも構わないので細胞培養の実験書の該当箇所をいまいちど落ち着いて読んでみることを勧めます。培養に使うPBSの調製はたいへん基本的な事なので必ず出ていると思います。

トリプシンを避けるのは何故？ 削除/引用 No.1893-28 - 2008/09/07 (日) 12:22:39 - K ATCCのウェブサイトではセルスクレイバーを用いるプロトコールが紹介されていますね。（だからといってトリプシンが使えないわけではないと思います） さっとＰｕｂｍｅｄで調べたら J Pharm Sci1997 Jul;86(7):786-90.で「トリプシン処理するとＴＭＡＧリポソームの結合を弱めたが、培養プレートからＲＡＷ２６４．７をはがすには至らなかった」という記述があります。（きちんと調べていないので、なぜトリプシンが適さないのかが未だわかっていません・・・）私もトリプシンが適さない理由に興味があります。 リドカインについては以前このフォーラムで話題になりましたが、濃度によっては細胞毒性を与えるため、実験の目的によっては考慮しなければならないようです。 　細胞培養、奥が深いです。

(無題) 削除/引用 No.1893-27 - 2008/09/06 (土) 21:31:44 - syokuhin >りょうさん > 確か何かの情報でRAW264はトリプシン使用は避けるべきというのを読んだ記憶があります。 トリプシンの使用を避ける理由が気になります。 教えていただけないでしょうか。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1893-26 - 2008/09/06 (土) 21:28:44 - syokuhin >atsさん > syokuhinのものは、生化学実験に汎用される組成です。 PBSについてのたくさんのご指摘をいただきまして、私の作っていたPBSに不安を感じていたのですが、汎用されるものなのですね。安心しました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1893-25 - 2008/09/06 (土) 21:22:43 - syokuhin >mom-aさん 培養・実験に不慣れなもので、説明がわかりにくくなってしまいました。申し訳ありません。 > 例えば、回収前の細胞の状態はどうでしたか？ 細胞はがっちり貼り付いており、ディッシュの80％くらいになっていました。増殖速度も遅くはなかったので、細胞の状態は悪くなかったと思います。 > 使っているdishはコーティングしてありますか？ dishはコーティングしてありません。 > 細胞によっては回収時の遠心が強すぎてダメージを受ける場合もあるでしょう。 遠心は強すぎることはないと思うのですが…。検討してみます。 > トリパンブルーが蒸発して濃度がものすごく濃くなっているなんてことはないですか？ 同じトリパンブルーを使っている人がいるのですが、細胞に以上が生じることはないそうです。 私は細胞を使った実験には不慣れなので、mom-aさんの仰るように、思いもよらないところで失敗をしている可能性が高いですね。 アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1893-24 - 2008/09/06 (土) 20:59:06 - syokuhin >IRESさん > ラバーポリスマンで剥がす際にはかなり注意深く行わないと大半の細胞は死んでしまいます。難しいようであればトリプシン/EDTAで剥がすことをお勧めします。 アドバイスありがとうございます。 大半の細胞が死んでしまうとは…！！私の剥がし方は少々強すぎたのかもしれません。 トリプシン/EDTAで剥がすのがよいようですが、回収した細胞を実験に使っても、実験結果に影響しないのでしょうか。気になります。

(無題) 削除/引用 No.1893-23 - 2008/09/06 (土) 20:51:02 - syokuhin > ~さん どうやらPBSにもたくさんの作り方があるようですね。いろいろ作って比較してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1893-22 - 2008/09/06 (土) 20:46:32 - syokuhin >おおさん > 細胞が弱っている状態で回収しているとか、マイコプラズマがコンタミしているとかいうのもあるかもしれません。 > > ディシュのメーカーをかえたらうまく行った(細胞の調子がよくなったとか)なんていうケースもチラホラ聞きます。 細胞の状態やコンタミの問題はないと思うのですが、ディッシュのことは考えたことがありませんでした。さっそく検討してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1893-21 - 2008/09/06 (土) 20:42:27 - syokuhin >名無しさん >> PBSってNa2HPO4とKClとKH2PO4とNaCl決まった量混ぜてつくってpHは合わせなくてもpH7.2~7.4になると長い間思ってたのですが、見るとなんか作り方違うみたいなのですが最近変わったのでしょうか。 私が研究室の先輩から教えていただいた作り方がその作り方だったので、そう作っていました。違う作り方もあったのですね。 メッセージありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1893-20 - 2008/09/06 (土) 20:34:56 - syokuhin >うーんさん >>トリプシンで剥がすか、リドカインでかがすか、cold roomで剥がすか… リドカイン、cold roomは今まで使ったことがありません。ぜひ検討してみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1893-19 - 2008/09/06 (土) 20:29:24 - syokuhin >まっくろんさん >>「はがす」というより「dishをなぞる」感じで回収していました。 私は今まで、dishをキュッキュと磨くような感じで細胞を回収していました。力を入れすぎですね…。そのせいで細胞が死んでしまったのかもしれません。 今度から「なぞる」感じで回収してみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1893-18 - 2008/09/06 (土) 20:16:14 - syokuhin お返事が遅くなってしまってすみません。 アドバイスありがとうございます。 >TFさん これは実験が目的の作業です。RAW264は接着が強いので、継代のときはトリプシンを使って剥がしているのですが、実験に使うとなるとトリプシンの影響が気になるので、物理的に剥がしています。 しかし物理的に剥がすのも、細胞が傷んでしまう危険性があるのですね。あまり気にしていませんでした。ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1893-17 - 2008/09/05 (金) 14:14:36 - IRES > 視細胞 死細胞の間違いです。

(無題) 削除/引用 No.1893-16 - 2008/09/05 (金) 14:13:32 - IRES >[Re:13] りょうさんは書きました : > 確か何かの情報でRAW264はトリプシン使用は避けるべきというのを読んだ記憶があります。 それは初耳です。 なぜ避けなければならないのでしょうか？トリプシンをつかっても特に視細胞が出るようなことはこれまでありませんでしたが... 後学のため、是非ご教示いただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.1893-15 - 2008/09/05 (金) 13:05:34 - りょう >[Re:14] 外野さんは書きました : > NaH2PO4とNa2HPO4を適切な比率で混合した溶液と、NaH2PO4溶液にNaOHを適切な量加えたものは、組成としては全く同一です。もちろん後者にも緩衝作用はあります。 そうなんですね。間違ったこと書いてすみません。

(無題) 削除/引用 No.1893-14 - 2008/09/05 (金) 12:46:22 - 外野 NaH2PO4とNa2HPO4を適切な比率で混合した溶液と、NaH2PO4溶液にNaOHを適切な量加えたものは、組成としては全く同一です。もちろん後者にも緩衝作用はあります。

(無題) 削除/引用 No.1893-13 - 2008/09/05 (金) 12:42:09 - りょう 確か何かの情報でRAW264はトリプシン使用は避けるべきというのを読んだ記憶があります。 それゆえ私は以前、この細胞を扱った時にPBS-EDTAではがして継代していました。 かなり接着能は強いので、強めにピペットで液を吹きつけてはがしました。 本題と違う話の方(トピ主さんのPBS組成の書き方）ですが、１Naと2Naを混合してpHを合わせたのなら緩衝作用あるでしょうが、１Naだけを溶かして、HClかNaOHでpH合わせているだけなら緩衝作用ないでしょう。 細胞死とは関係ないでしょうが・・・

(無題) 削除/引用 No.1893-12 - 2008/09/05 (金) 12:02:45 - ats またまた、本題からはずれますが > NaClとNaH2PO4だけではバッファーにならなくないですか？ pHを調整していると最初に書いてあるので、バッファーになっているでしょう。 でも厳密にpHを気にしないのであればNaCl,NaH2PO4,Na2HPO4を混ぜて20xとか作り、薄めて使う方が楽ですね。実際には、20xD-PBSの作り置きがあるので、こっちを使っています。 （sigma社製は、D-PBSよりHanks BSSさらにDMEMの方が安いのでビックリ、販売量の違いか？）

えっと… 削除/引用 No.1893-11 - 2008/09/05 (金) 11:37:31 - mom-a atsさんに文句があるわけではないのですが ＞名無しさんのPBSは、おそらく「ダルベッコのPBS(D-PBS)」と呼ばれる培養細胞用に汎用されるものですね。 多分そうでしょうね。作り方については~さんのおっしゃるとおり、2通りあると思います（あと、お金持ちなら市販品を買う。）それは良いのですが、 ＞syokuhinのものは、生化学実験に汎用される組成です。 NaClとNaH2PO4だけではバッファーにならなくないですか？ NaClとNaH2PO4とNa2HPO4ならいいですが、そうだとsyokuhinさんの書き方は？と思います。それで、まだ実験に慣れていらっしゃらないのかな？と思ったのですが…。

(無題) 削除/引用 No.1893-10 - 2008/09/05 (金) 10:51:49 - ats 本題ではないですが、 名無しさんのPBSは、おそらく「ダルベッコのPBS(D-PBS)」と呼ばれる培養細胞用に汎用されるものですね。syokuhinのものは、生化学実験に汎用される組成です。

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