全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1890-15 - 2008/09/09 (火) 14:55:59 - AP >>今は湿箱にいれて発色液をこんもり載せてやっています。 >この場合はカバーしないでOver nightしても、乾燥しないですか？ 湿箱にいれて置けば、そんなに乾かないようですが。縁のほうは少し干上がることもあります。 >PAPPENは使用してますか？ 使っていません。あれば使うかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.1890-14 - 2008/09/09 (火) 07:01:48 - neko >APさん 参考になりました。ありがとうございます。 >今は湿箱にいれて発色液をこんもり載せてやっています。 この場合はカバーしないでOver nightしても、乾燥しないですか？ PAPPENは使用してますか？

(無題) 削除/引用 No.1890-13 - 2008/09/06 (土) 14:57:40 - AP >ちなみにNBTとBCIPの比率を間違えても、一応シグナルは出るんですか？ 極端なはなしAPの基質はBCIPなので、それだけでもでます。青白っぽいので非常に見難いですが。共役反応としNBTの還元が起こることで、はっきりした青紫〜赤紫のファイルマザンが形成されます。 たぶん、オリジナルの混合比はBCIPの脱リン酸化、酸化と共役反応のNBTの還元が理論的につりあうような比率なんだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1890-12 - 2008/09/06 (土) 14:13:45 - AP >今はプレパラート上に乗せて、その上にパラフィルムをかぶせています。 昔は、パラフィルムを乗せていましたけれど、今は湿箱にいれて発色液をこんもり載せてやっています。パラフィルムをかぶせると、発色液が非常に薄い層になって基質の拡散が制限されるせいか、かえってムラになりやすいかったからです。

(無題) 削除/引用 No.1890-11 - 2008/09/06 (土) 12:50:20 - neko >それとプレパラート上に液を乗せて発色させていますか？それとも染色瓶に立てて行ってますか？ 今はプレパラート上に乗せて、その上にパラフィルムをかぶせています。 以前は染色びんを使ってやってました。 プレパラート上にのせてやると、むら(濃い部分と薄い部分)ができることがあるのですが、 みなさんはむらができないように何か工夫されてますか？

(無題) 削除/引用 No.1890-10 - 2008/09/06 (土) 12:44:37 - neko probeによって違いはありますが、4度でO/Nで問題ない場合が多いと思います。 封入する前にアルコール脱水すると、少しバックが落ちるので、バックが高い場合はちょうどよくなることもあります。 >BCIP溶液の説明書では、半端な数字を嫌ったせいか、4.5 uLと3.5 uLとなっていたと記憶します。NBTとBCPIの比率が異なると、若干色調が変わります。 確かにNBTとBCPIの比率は中途半端だと思ってました。 ちなみにNBTとBCIPの比率を間違えても、一応シグナルは出るんですか？

PVA 削除/引用 No.1890-9 - 2008/09/05 (金) 17:19:57 - ISH 10%ポリビニルアルコール(PVA)ベースで発色液を作って、O/Nぐらいでゆっくり発色させるとバックは幾分抑えられます。もちろんプローブ濃度やハイブリの温度を検討することがまず第一だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1890-8 - 2008/09/05 (金) 13:38:19 - EcoRI >たぶん、オリジナルの発色液の濃度は1 mL当たり、NBT 4.4 uL、BCIP 3.3 uLです。ベーリンガーが出していたNBT溶液、BCIP溶液の説明書では、半端な数字を嫌ったせいか、4.5 uLと3.5 uLとなっていたと記憶します。NBTとBCPIの比率が異なると、若干色調が変わります。 ロシュのDIGマニュアルも 4.5, 3.5 ul/ml だったと記憶しています。 私の場合、検出にしか用いないので(定量は主にELISA, westernの場合もありますが)、 多少色調が変わろうが、気にしません。 わざわざ、ピペッターの目盛りを変えるのが、面倒だった という、感心しない理由で、4, 4にしているのです。

(無題) 削除/引用 No.1890-7 - 2008/09/05 (金) 00:24:41 - AP >イメージ的に濃い濃度で発色させるとバックが強く出る風に考えており、 染色液が濃くてもそういう傾向があると思いますが、他の方もかかれているとおり、バックが高くてS/Nが悪くなる場合は、プローブ濃度を下げたほうがよい結果が得られると思います。特にハイブリ時間がいつでも一定しているような場合には。簡単にいうと、特異的なハイブリは、ハイブリ時間が十分長ければ、プローブ濃度に関係なく同程度まで進むのに対し、非特異的な吸着はプローブ濃度に比例して高くなっていくからです。 >発色があと少しというところで帰宅する場合はみなさんは4度に移したりしているのでしょうか？ たいていは、1時間以内に止めるのでそのままやってしまいます。 Rocheによると、anti-DIG-APを反応させて洗ったあと、冷蔵庫で1週間保存した後でも、遜色なく検出できるということです（うろ覚え、メンブレンの検出だったと思いますが）。洗いの状態で止めて、次の朝から検出でもいいと思います。 >それとプレパラート上に液を乗せて発色させていますか？それとも染色瓶に立てて行ってますか？ 数が少ないのと、試薬を節約するので、プレパラートに発色液を乗せてやっています。数が多かったり、反応時間が長い場合は染色ジャーの方が便利でしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1890-6 - 2008/09/04 (木) 23:42:56 - あう ご教授ありがとうございます。 イメージ的に濃い濃度で発色させるとバックが強く出る風に考えており、また翌朝きて真紫になっているとかなしいので、ロシュのプロトコールよりも薄めにして反応させておりました。 顕微鏡で見ながら止めるのが理想的ではありますが、2日目が夕方くらいに終わってそこから数時間というと帰宅が遅くなってしまい抵抗がありました。 発色があと少しというところで帰宅する場合はみなさんは4度に移したりしているのでしょうか？ それとプレパラート上に液を乗せて発色させていますか？それとも染色瓶に立てて行ってますか？

(無題) 削除/引用 No.1890-5 - 2008/09/04 (木) 19:08:09 - AP EcoRIにのっかります。 NBT, BCPIの粉末をバラで買ったほうが安上がりだし、長持ちします。 BCPIはトルイジン塩です。ナトリウム塩とおまちがいなく。ナトリウム塩は水には溶けますがDMFには溶けません。水に溶かしたBCIPはすぐに劣化します。 たぶん、オリジナルの発色液の濃度は1 mL当たり、NBT 4.4 uL、BCIP 3.3 uLです。ベーリンガーが出していたNBT溶液、BCIP溶液の説明書では、半端な数字を嫌ったせいか、4.5 uLと3.5 uLとなっていたと記憶します。NBTとBCPIの比率が異なると、若干色調が変わります。

(無題) 削除/引用 No.1890-4 - 2008/09/04 (木) 18:53:46 - EcoRI ISHではなく、western や plaque hybriの話で恐縮ですが。 NBT/BCIPの自己反応が嫌なので、 NBT を75 mg/ml 70% DMF, stored in -20度 BCIP を 50 mg/ml DMF, stored in -20度 として、DIG Buffer 3 10 ml に 40 ul ずつ加えたものを 基質発色液としています。

(無題) 削除/引用 No.1890-3 - 2008/09/04 (木) 18:45:36 - AP 室温で反応させながら、時々顕微鏡で見て適当なところで止めます。 早いものなら10分から1時間くらい、長くて一晩というところです。 検出するものによって違いますし、場合によっては早めに止めるのと、長め、過剰気味に反応させるのと両方作ります。マウントすると薄くなるので、チェックで見た時に、やや濃い目のところで止めるとちょうどいい感じです。 >ロシュのNBT/BCIPストックソリューションを溶媒10mlあたり50μl添加して たしか、標準は10 mLについて200 uLなので、やや薄めですね。反応時間が長くなりがちなのはそのせいでしょう。まあ、保存中に析出したり反応したりして実質的な濃度が下がっているだろうなと思っても、気にせず使っていたりするし、染色具合を目で確認するなら、それくらいの濃度の違いはどうということないでしょう。 ただ、長時間反応させると、どうしてもバックが曇ってきますね。 ひとつには、反応産物のフォルマザンが100%、直ちに沈着するわけではなく、発色液中にも拡散してくるので、それがよくないのだと思います。私は、長時間の反応では、途中で何回か、軽く洗って新しい発色液に替えます。 また、NBT/BCIPストックの色素の析出や、発色バッファー中のごみなどがバックグラウンドを汚すことがあるので、発色液は0.4 umのフィルターを通してから使います。

(無題) 削除/引用 No.1890-2 - 2008/09/04 (木) 18:30:48 - 組織 ロシュのプロトコール通りにやってます。いわゆるDIG3 buffer 10 mLに対して、NBT/BCIPストックを200 uL加えて、室温で30分〜24時間くらい反応させています。 経験上、バックはプローブ由来のものが多いと感じています。シグナルがちゃんと出ているのなら、プローブを希釈すればもう少しコントラストが良くなるのではないでしょうか。ISHは操作が多く、あれこれ変えるとプロトコールが定まらないので、まずはプローブ濃度くらいから始められる方が無難だと思います。私なら、今の濃度から10倍、50倍、100倍くらいは振ってみます。かなり希釈しても、意外とシグナルは残ってくれます。

IN　SITU　HybridizationのNBT/BCIP発色について 削除/引用 No.1890-1 - 2008/09/04 (木) 12:32:46 - あう お尋ねしたいのですが。 私はISHをロシュのDIGシステムを使って、最終的にNBT/BCIP発色で行っています。色々な本にプローブやハイブリの温度・時間については検討されていますが、最後の発色反応をどのように行うかで今迷っています。 これまではロシュのNBT/BCIPストックソリューションを溶媒10mlあたり50μl添加して室温でOVER NIGHTから24時間くらいで発色させていました。 結果はだいたい出るのですがなんとなく全体にバックが高く出るような感じがしておりました。 皆さんは発色反応はどのようなプロトコールで行っていらっしゃいますか？ よろしければ教えてください。

全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---