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(無題) 削除/引用 No.1886-8 - 2008/09/06 (土) 09:39:31 - おお >[Re:7] SOSさんは書きました : > アドバイスありがとうございます． > > プレート作製時に，洗浄操作は普通行うものなのでしょうか？ > 行わなくても良いのでしょうか？ お示しのプロトコールから察するにせんじょうが必要という感じではないですし、そんなに改善が見込まれるような気がしません(ただ、お示しのシステムは使ったことがありませんので確実なことではありませんが)。 PBSTのtweenの濃度を2ー5倍上げてみるとかTritonX-100を使ってみるとかで幾らか改善するかもしれません。

ELISA plateの作製-3 削除/引用 No.1886-7 - 2008/09/06 (土) 09:18:13 - SOS アドバイスありがとうございます． プレート作製時に，洗浄操作は普通行うものなのでしょうか？ 行わなくても良いのでしょうか？ これらは，ものによって異なるということでしょうか？ 教えてください．

(無題) 削除/引用 No.1886-6 - 2008/09/05 (金) 14:15:45 - おお あとアフィニティーカラムでよく使われる方法で、プレイトに固定するタイプのものもあるそうです。

(無題) 削除/引用 No.1886-5 - 2008/09/05 (金) 10:22:36 - まっくろん 　おおさんのおっしゃる通りプレートによる違いもありますよね。私も、スミロンのELISA用プレートでうまくいかなかったものが、BDやNuncに変えたらうまくいったという経験があります。プレートと言っても安くないので、業者に「検討したいからELISAプレートのサンプルを欲しい」といって、いろんなところのELISAプレートをもらって検討されるのも、一つの手かも知れません。

(無題) 削除/引用 No.1886-4 - 2008/09/05 (金) 04:33:09 - おお プレイトをかえるてもあるかもと思いました。メーカーによっては吸着力が違う3種類ぐらいのプレートを売っているようですし、

ELISA plateの作製-2 削除/引用 No.1886-3 - 2008/09/04 (木) 08:20:13 - SOS マチさん，ありがとうございます． ビオチン化抗体は，市販品を使用しました． 一次抗体を96well　plateに100μL/well添加し，4℃で，1晩インキュベートした後，抗体溶液を除去し， ブロッキング剤は，IMMUNO-TEK　ELISA　Construction　Systemに含まれていた，ZeptoBlock液を200μL/well添加し，室温で2時間インキュベートしています． ZeptoBlockの中身はわかりません． ブロッキング剤を除去した後は，ZeptoCoat(安定化剤)を100μL/mL添加し，室温で1時間インキュベートします．溶液を除去して乾燥して終了しました． plate作製時に，洗浄操作は，行っていません．これが原因でしょうか？ 測定時の洗浄液はPBST(0.05%Tween20　in　PBS)を使用しています． よろしく，お願いいたします．

(無題) 削除/引用 No.1886-2 - 2008/09/03 (水) 21:07:56 - マチ 察するに、あちこちに非特異吸着しているのですね。 でしたらまずはブロッキングかと。 自分でビオチン化したものは修飾の程度にもよりますが、非特異は出やすいものですので、まずはそこからですね。測定対象の非特異はその後です。 現在のブロッキングの条件と、洗浄に用いているバッファー（加えているのであれば界面活性剤やブロッキング剤の濃度も）を教えて下さい。 私でわかる範囲でお答えしたいと思います。

ELISA plateの作製 削除/引用 No.1886-1 - 2008/09/03 (水) 16:54:57 - SOS IMMUNO-TEK　ELISA　Construction　Systemを使用して，サンドイッチELISA測定系を作ろうとしています． 取扱説明書には，plateに抗体を結合する際に，洗浄操作について特筆してありませんが，stepごとの洗浄操作は必要ないのでしょうか？ 洗浄操作を行わずにplateを作製し，測定を実施し(測定の各stepでは，洗浄操作を行いました)たところ，まず，�@ビオチン化した2次抗体が，plateそのものに結合することが分かりました．�A固相化抗体(1次抗体)に，測定対象化合物を介さずに，かなりの量の2次抗体が結合することが分かりました．�B測定対象化合物がplateそのものに，微量ではありますが，濃度依存的に結合していることが分かりました． その結果，バックグラウンドが高くなり，検量線が作成できませんでした． 測定の際の洗浄操作は，マイクロプレートウオッシャーを用いて，5回洗浄を実施しました． 原因について 1)plate作製方法が間違っている． 2)ブロッキング剤が適切でない． 3)洗浄不十分 など考えていますが， 何かもっと基本的なことが間違っているのでしょうか． アドバイスをしていただけるとうれしいです．

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