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CDスペクトル 削除/引用 No.1880-7 - 2008/10/21 (火) 06:44:42 - K Decrease NaCl concentratiion If the protein is soluble, just use 10 mM phosphate as a solvent. "0.5M NaCl" is too high. http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/course/section8/ss-960531_21.html A typical buffer used in CD experiments is 10mM phosphate, although low concentrations of Tris, perchlorate or borate is also acceptable. Potassium fluoride is preferred to NaCl for increasing the ionic strength as chloride ion has a strong UV absorbance at low wavelengths.

(無題) 削除/引用 No.1880-6 - 2008/10/18 (土) 16:37:54 - later1 まず、マニュアルの熟読をお勧めします。 その上で単純に言いますと、通りすがりさんが言われたように、CDを測るときに重要なのは吸光度です。 大きいとCDのノイズが大きくなり測定不能になります。 逆に小さすぎるとCDも小さくなりすぎて測れません。 つまり、測定したい波長域における吸光度=HT電圧が適当な大きさになるような条件を整えればよいのです。 吸光はbufferも含めたトータルで考えます。 酸素やセルの汚れも影響がありますので注意してください。 何もしなくても初めからHT電圧が高いのなら内部の部品劣化なのでメンテナンスが必要です。

(無題) 削除/引用 No.1880-5 - 2008/10/16 (木) 00:34:04 - EEE タンパク濃度で質問があります。 「普通、0.1-0.3mg/mL(1mm cell length)で測定します」 とありますが、 分子量が数万のもの、抗体のように15万のものでも、 大体0.1-0.3 mg/mL なのでしょうか。 経験・知識のある方、宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1880-4 - 2008/09/06 (土) 00:57:46 - 通りすがり 理想的な濃度というのは聞いた事はありません。 普通、0.1-0.3mg/mL(1mm cell length)で測定します。 CDは、左右の偏光の吸収差を観測しています。 (詳しくは、文献等を参考にして下さい) つまり、少し語弊がありますが、吸収スペクトルと同じです。 濃度が薄すぎると、入射光と透過光の強さがあまり変化せず、吸収差がきちんと観測されない(絶対的なCD強度が小さい)ので、相対的にノイズの大きなスペクトルになります。 また、逆に濃すぎると、吸収が大きすぎて、透過光がほとんどなくなります。この少ない透過光の信号を、ホトマルで増幅する為、電気信号のノイズが大きくなります。 蛋白質は実際に、200nm以下は非常に大きな吸収帯を持っています。 また、200nm以下は、空気中の酸素も吸収を持ちます。 (NaClも同様) 長々と書きましたが、200nm以下は観測する光(透過光)が非常に微弱である為にノイズが大きくなります。 最後にひとつ付け加えたいのですが、200nm以下のスペクトルに、構造に関する本質的な情報は含まれて入ないと思うので、無理して測定しなくても良いのではないでしょうか？ 逆に無理して測定して、ホトマル電圧が1000Vとかになると、CD分光器が壊れてしまいますよ。 あまりまとまっておらず、駄文になってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.1880-3 - 2008/09/05 (金) 20:13:51 - 井上 ありがとうございます。 参考にして実験してみます。 �Aについて次の機会に検討する予定でしたが、 タンパク濃度については参考になりました。 CDについて知識があまりないのですが、 タンパク濃度は大きく影響するのでしょうか。 どのくらいの濃度が理想なのでしょうか．

(無題) 削除/引用 No.1880-2 - 2008/09/05 (金) 19:14:00 - 通りすがり �@蛋白質濃度を下げる：0.2mg/mL位でいいのでは？ �A(可能ならば)塩濃度を下げる �B(少し危険だが)スペクトルのバンド幅を上げる(1nmを2nm)など �@、�Aが現実的だと思います。 �Bですが、日本分光だとタンパク質は1nmで測定しろと書いてます。 これは、それ以上だとペプチド結合が切断されるためであると書いてますが、以前、試しに測定してみたところ、１時間以上、2nmのビームをあてても、スペクトルは変化していませんでした。 参考にしてください。

CDスペクトル 削除/引用 No.1880-1 - 2008/09/03 (水) 07:23:57 - 井上 CDスペクトルを測定した時、 190-200nmでノイズが出てしまいます。 （シグナルが上下に2･3回行ったり来たりする） どのようにすれば改善できますでしょうか。 条件は、 タンパク質濃度：0.3mg/mL 測定波長：190-250nm セル幅:0.1cm 希釈液(溶解液）：0.5M NaClを含む10mMリン酸塩Buffer 測定積算回数：8回

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