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ガラスベースディッシュのコーティング（２９３Ｔ細胞） トピック削除
No.1876-TOPIC - 2008/09/02 (火) 20:47:00 - in situ
293T細胞にプラスミドをtransfection後、固定し、観察するという実験をしています。（諸事情により、剥がれ易さには目をつぶって293T細胞をわざわざ使わざるを得ない状況です）

最終的に共焦点顕微鏡で観察するため、IWAKIのガラスベースディッシュを使用していましたが、いまいち接着が悪く、下手すると半数以上の細胞が操作中にいなくなってしまいます。（transfectionによるダメージもあるのだと思います）

松波ガラスから、PLLコートのガラスベースディッシュも取り寄せてみましたが、IWAKIのノンコートのものより接着が悪く、改善が見られませんでした。

次の対策としては、
１．BDから出ているPDLコートのディッシュを試してみる
２．自分で何らかのコーティングをする
３．カバーガラス上での培養に変更する
（３．は実験系としてあまり都合よくありません）
といったことを考えていますが、自分のラボでは、普段シャーレをコーティングしていないため、コーティング材を購入しなければなりません。

コーティング剤として、ゼラチン・コラーゲン・リシンなどがあると思いますが、293T細胞の接着を良くするのに良いコーティング剤をご存じの方いらっしゃいましたら、ご教授願います。
よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.1876-8 - 2008/09/25 (木) 17:38:07 - in situ
遅くなりましたが、Ｔさまに教えて頂いたCell matrix I-Pをガラスベースディッシュにコートし、293Tを培養・固定したところ、著効しました。

前は半分近くの細胞がはがれてしまっていたのですが、今回は9割以上の残存率でした。

ご助言頂いた皆様、特にＴさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1876-7 - 2008/09/03 (水) 09:15:34 - ats
TOYOBOのコラーゲンコート液（TMTCC-050）を利用しています。
SH−SY5Y細胞では、さらにPEIコート(PLLコートの代用）して接着性を高めたこともあります。

(無題) 削除/引用
No.1876-6 - 2008/09/02 (火) 21:56:21 - in situ
＞Ｔ様

非常に有用な情報、ありがとうございます。
早速購入を検討してみようと思います。


他にも、異なるコーティング剤の比較を行った方などいらっしゃいましたら、返信を期待しております。

(無題) 削除/引用
No.1876-5 - 2008/09/02 (火) 21:38:59 - T
293T もやはり付きます。確かに 293 の親株よりは接着性が落ちるかもしれません。
論文でもよく使われているので、検索されるといいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.1876-4 - 2008/09/02 (火) 21:25:41 - in situ
りょう様、Ｔ様、返信ありがとうございます。

＞りょう様

実は、293Tを使う前は293で同じ実験をやっていたのですが、その時はIWAKIのノンコートガラスベースディッシュで問題なく接着していたのです。
293Tは、293の亜種というより、接着性もろもろ、全く別の細胞と考えたほうが良いような挙動を示します。
ですので、今回に関しては293T細胞限定の質問ということでよろしくお願いします。

ちなみに、transfection reagentに関しても、実験の制約上、特定のものしか使えない状況です。。

＞Ｔ様

新田ゼラチンの Cellmatrix I-Pを293Tでご使用された経験はありますでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1876-3 - 2008/09/02 (火) 21:14:12 - T
293 はコラーゲンコートによく付きます。PLL, PDL はあまり適しません。
プレコートのものも売っていますが、自分でコートした方が安上がりで接着も良いです。
うちでは新田ゼラチンの Cellmatrix I-P というのを買っています。

(無題) 削除/引用
No.1876-2 - 2008/09/02 (火) 21:01:47 - りょう
293Tではなく293を使用しておりますが、コラーゲンコートでくっつきます。
カバーガラスを自分で37度で１時間以上コートし、PBSで３回washして、その上に細胞をまいています。
最低4時間-最高O/N接着後、トランスフェクトの操作を行います。
lipofectamine-LTXが毒性低くてお勧めです。

PLLとの比較はやったことありません。

同じラボにいる人が同じ手法で行っても汚い像しか取れないことがありますから、実験者の手際・センスも重要でしょう。

ガラスベースディッシュのコーティング（２９３Ｔ細胞） 削除/引用
No.1876-1 - 2008/09/02 (火) 20:47:00 - in situ
293T細胞にプラスミドをtransfection後、固定し、観察するという実験をしています。（諸事情により、剥がれ易さには目をつぶって293T細胞をわざわざ使わざるを得ない状況です）

最終的に共焦点顕微鏡で観察するため、IWAKIのガラスベースディッシュを使用していましたが、いまいち接着が悪く、下手すると半数以上の細胞が操作中にいなくなってしまいます。（transfectionによるダメージもあるのだと思います）

松波ガラスから、PLLコートのガラスベースディッシュも取り寄せてみましたが、IWAKIのノンコートのものより接着が悪く、改善が見られませんでした。

次の対策としては、
１．BDから出ているPDLコートのディッシュを試してみる
２．自分で何らかのコーティングをする
３．カバーガラス上での培養に変更する
（３．は実験系としてあまり都合よくありません）
といったことを考えていますが、自分のラボでは、普段シャーレをコーティングしていないため、コーティング材を購入しなければなりません。

コーティング剤として、ゼラチン・コラーゲン・リシンなどがあると思いますが、293T細胞の接着を良くするのに良いコーティング剤をご存じの方いらっしゃいましたら、ご教授願います。
よろしくお願いします。
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