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(無題) 削除/引用 No.1866-13 - 2008/09/02 (火) 13:14:19 - student > 話は別ですが、おおよそ挿入領域がわかっていて、ゲノム配列情報があるなら、 > その配列からいくつかプライマーを見繕って、ベクターのプライマーとで普通のPCRでもいいかもしれません。これだとスパンが結構長くても、PCRがかかるのではないでしょうか。 おっしゃる通り始めに予想させる位置にいくつかのプライマーを作成してゲノムＰＣＲを行ったのですが、ポジティブなバンドが得られませんでした。 プライマーがよくないのか、挿入の位置が違うのかわかりません。 もしくはこのtrap vectorの挿入位置自体が目的の遺伝子でないＥＳのクローンである可能性も捨て切れません。 そこでinverse PCRを行って挿入位置の正確な位置を決めようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.1866-12 - 2008/09/01 (月) 22:59:05 - AP >コヘッシブにならない、 ↑ 「なる」ですね。 >ゲノム切断に実績のある酵素は他の生物種での実績でも問題はないと思ってよろしいですよね。 基本的にはどの生物であっても、精製してしまえばDNAは物質として同じなのでそう考えていいと思います。 CpGメチル化がない生物もいますので（たとえばショウジョウバエ）、そういうのの切断効率は参考にしないほうがいいかも。 どんな酵素であれゲノム全体でみると全く認識配列がないというものはめったにないですから、どれを使っても切れることは切れるでしょう。 でも、6塩基認識酵素なんかだと、数十kbにもわたって一回もサイトが出てこないという場合もありますから、確率的に頻度の高い4塩基認識がいいわけです。 話は別ですが、おおよそ挿入領域がわかっていて、ゲノム配列情報があるなら、 その配列からいくつかプライマーを見繕って、ベクターのプライマーとで普通のPCRでもいいかもしれません。これだとスパンが結構長くても、PCRがかかるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1866-11 - 2008/09/01 (月) 22:04:51 - student すいません。 また図中のプライマーの位置がずれてしまっていました。 再度投稿します。 これが正確な図です。 genome(intron ) 　　　　　　　　　　　　trap vector -------------------=========================================== |　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 | A site 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　A site 　　　　　　　　　　　　　　　　 <----primerR 　　　　　　　　　　　　　　　　　　primerF----->

(無題) 削除/引用 No.1866-6 - 2008/09/01 (月) 21:53:02 - student 図中のスペースが抜けてしまったようです。 半角スペースはなくなってしまうのでしょうか。 もう一度投稿します。 おお様、ＡＰ様 とても参考になるご意見ありがとうございます。 説明が足りず申し訳ありません。 私が行おうとしているiverse PCRは genome(intron ) trap vector -------------------============================== |　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 | A site 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　A site 　　　　　　　　　　 <----primerR 　　　　　　　　　　　　primerF-----> のような図の場合 A siteの 制限酵素で切断、環状化を行い、primerRとFで増幅したときに1kbp以下になると思われるものを探した次第です。 勘違いをしていたのは primerFは右側のA siteの直前に設計すればするほど増幅産物の長さを短くできますね。 A site間の長さを1kbpと考えてしまっていました。 また左側のA siteとtrap vectorの正確な距離はわからないわけで、そこはintron内にいくつかのA siteがあればいいということにもなりますね。 そうすれば使用できる酵素も他にありそうです。 それらの酵素の中から メチル化されない、 コヘッシブにならない、 ブラントは避ける、 ゲノム切断の実績のある酵素を使用する を基準に選択すればよさそうですね。 ちなみに、念のためにお伺いしたいのですが、 ゲノム切断に実績のある酵素は他の生物種での実績でも問題はないと思ってよろしいですよね。

(無題) 削除/引用 No.1866-5 - 2008/09/01 (月) 21:36:33 - student おお様、ＡＰ様 とても参考になるご意見ありがとうございます。 説明が足りず申し訳ありません。 私が行おうとしているiverse PCRは genome(intron ) trap vector -------------------============================== | | A site A site 　　　　　　　　 <----primerR primerF-----> のような図の場合 A siteの 制限酵素で切断、環状化を行い、primerRとFで増幅したときに1kbp以下になると思われるものを探した次第です。 勘違いをしていたのは primerFは右側のA siteの直前に設計すればするほど増幅産物の長さを短くできますね。 A site間の長さを1kbpと考えてしまっていました。 また左側のA siteとtrap vectorの正確な距離はわからないわけで、そこはintron内にいくつかのA siteがあればいいということにもなりますね。 そうすれば使用できる酵素も他にありそうです。 それらの酵素の中から メチル化されない、 コヘッシブにならない、 ブラントは避ける、 ゲノム切断の実績のある酵素を使用する を基準に選択すればよさそうですね。 ちなみに、念のためにお伺いしたいのですが、 ゲノム切断に実績のある酵素は他の生物種での実績でも問題はないと思ってよろしいですよね。

(無題) 削除/引用 No.1866-4 - 2008/09/01 (月) 20:26:59 - AP 念のため、 ベクターを全く切らない酵素で切って、環状化すればinverse PCRで両側いっぺんに取得することも可能なわけですけれど、ひょっとしてそのために酵素の選択肢が少ないと悩んでいらっしゃるのでしょうか。 両側のflanking sequenceを取得したい場合でも、普通は、左側と右側、片側ずつPCRをするので、ベクター内部を切る酵素でもいいです。ベクターの片側とflanking genomeの断片が生じればいいのです。

(無題) 削除/引用 No.1866-3 - 2008/09/01 (月) 20:16:24 - AP なるべく短い断片になるようにしたほうがPCRがかかりやすいので、4塩基認識の酵素が第一候補ですね。6塩基でも、あらかじめ制限酵素サイトマップがあってプライマーアニーリングサイトを含む断片が比較的短くPCRが無理なくかかる長さ（たとえば1 kb以下）になることがわかっていれば、それでもかまわないでしょう。 ほ乳類ゲノムはCpG methylationがあるので、その影響のある酵素は避けます。 あとは、付着末端を生じる酵素ですね。 わたしはMboIやMspIを使うことが多いです。 inverse PCRの他では、vectorette PCRとかLM-PCRがあります。 ゲノムDNA断片にアダプターをligationして、アダプタープライマーとgene-specific primerでPCRをかけます。 ターゲット断片が必ずしも短かくなくてよくて、gene-specific primerの位置から、アダプターまでの距離が無理なくPCRがかけられるくらい短ければいいので、 使える酵素の自由度が高くなります。また、鋳型を環状化するinverse PCRより、 直鎖にアダプターをつけるほうが効率がいいので、成功率も高いです。アダプターを用意しなければならないところでコストが余計にかかりますが。

(無題) 削除/引用 No.1866-2 - 2008/09/01 (月) 19:12:28 - おお >その第一段階にゲノムを制限酵素で切断しますが、 >trap vectorの配列的に使用できそうな制限酵素に私がよく使用するような制 >限酵素がありません。(EcoRI, BamHI, BglII, notI NcoI, XhoIなど一般的に >遺伝 >子クローニングに使用するような酵素） なにか勘違いされているか本も思えますが、、、ベクターの断片が残っていれば何とかなるのではないでしょうか、、、あとベクター自身が切れなくてもいいはずですし、、、 AciI, BslI, BspCNI, BsrI, BfaI, BpmI, BstNI, BtgI, Cac8I, Eco57MI, FokI, HaeIII, Hinp1I, Hpy8I, HpyCH4III, ScrFI, MseI, MwoI, PfoI TaqII 随分マイナーなやつを並べていますね。 www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/fragment_size_by_cleavage.asp ここで、比較的短いフラグメントが得られそうなものを選ぶ。 末端がコンパチブルであれば複数の酵素を使うてもあるかと思います。 何処のイントロンに入っているかまで分かっているわけですから、制限酵素のマップから可能性を考えて酵素を選ぶこともできますね。 考慮する点をあげときます。 メチレーション(CpG)にセンシティブなものをさける。 http://www.nebj.jp/jp/products/productR0551.html AciIはメチル化でプロックされますね 末端がコヘッシブにならないのはさける。 www.nebj.jp/jp/products/productR0555.html BslIはセルフライゲーションに向かないと思いませんか? 切断後のライゲーション効率が高いものを選ぶ。 www.nebj.jp/jp/products/productR0568.html BfaIこれはライゲーション効率悪スギです。 ブラントは避けた方がいいとおもいます。 www.nebj.jp/jp/products/productR0108.html これプラントですよね。 ゲノムで実績のある酵素を使うのがいいです。タカラのカタログにはゲノムの解析に向いた酵素には染色体マークがついてたんではなかったかなぁ、、、、１度後確認ください。

inverse PCRに使用するゲノム切断用の制限酵素 削除/引用 No.1866-1 - 2008/09/01 (月) 17:49:13 - student trap vectorによる目的遺伝子のノックアウトＥＳ細胞を入手しました。 trap vectorの入っている位置はデータベース上で目的遺伝子のintron３内に入っていることはわかりますが、正確なゲノム上の位置がわかりません。 inverse PCRによってtrap vectorのゲノムの正確なゲノムを位置を決定しようとしています。 その第一段階にゲノムを制限酵素で切断しますが、 trap vectorの配列的に使用できそうな制限酵素に私がよく使用するような制限酵素がありません。(EcoRI, BamHI, BglII, notI NcoI, XhoIなど一般的に遺伝子クローニングに使用するような酵素） 私自身もゲノムの切断をあまり行ったことがありません。 ゲノムの切断には向いている酵素と向いてない酵素があると聞いたことがあります。 ゲノム切断に向いている制限酵素がありましたら、どなたか教えていただけないでしょうか？ そのtrap vectorに使用できる候補の制限酵素としては AciI, BslI, BspCNI, BsrI, BfaI, BpmI, BstNI, BtgI, Cac8I, Eco57MI, FokI, HaeIII, Hinp1I, Hpy8I, HpyCH4III, ScrFI, MseI, MwoI, PfoI TaqIIなどがあります。 またinverse PCR以外にtrap vectorの挿入位置を決定するお勧めの方法などはありますでしょうか？ よろしくお願いします。

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