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マーカーの問題でしょうか？ 削除/引用 No.1863-10 - 2008/09/22 (月) 16:38:43 - mom-a ・62kDaにバンドがみえるはず(これ以外は見えないはず)のマーカーを使ったのに62kDaのバンドが薄く、72kDaと92kDaにバンドがみえた。 ・そのとき、検体では72kDaにバンドがみえた。 プロトコール上大きな問題がなさそうであれば、マーカーが分解した、あるいはコンタミした、などは考えられないでしょうか？新規購入したものを使っていて、最初からこうだった…ということだと別のことを考えなければならないですが（一応、保存条件も確認するとして）。 あと、「抗体マーカー」とおっしゃるのが気になるのですが、ザイモフラフィーですから、抗体を流しているのではないですよね？ 新しいポジコン用のマーカーを購入する、あるいはあだむやんさんが書かれているように自分で単離して使う、などの方法はかがでしょうか。 ＞犬のMMP2が見られる位置は62KDaと書かれているものと、72KDaと書かれているものがあり混乱しています。。 あだむやんさんも書いていらっしゃいましたが、72kDaはproformMMP-2ではないでしょうか？どんな論文かにもよりますが、proformもごっちゃにして単にMMP-2とかMMP-9とか表記しているものもなくはないですが…。

アドバイス頂きありがとうございます。 削除/引用 No.1863-9 - 2008/09/22 (月) 15:33:11 - こねこ 確かに、私の回答不足でした、 わざわざご指摘頂きましてありがとうございます。 62KDaと92KDaの間に見えるバンドの分子量は大体72KDaになります。 ちょうどその隣に検体のバンドが見られます。 しかし、抗体メーカーに問い合わせた所、72KDaは見られず 62KDaにバンドが見られるはず、との事でした。 メーカーが推奨してくれた希釈倍率で抗体マーカーをroadした所 62KDaの所にうっすら白抜きバンドが見られました。 しかし、72KDaの場所にも92KDaの場所にもバンドは見られました。 メーカーが推奨してくれた希釈倍率が20倍希釈とかなり濃かった為 62KDaの場所にはバンドが確認されましたが、 72KDaと92KDaのバンドはかなり濃度が濃かったのか、スメア状に太いバンドになっています。 同じ抗体マーカーを使っている他の論文では、 抗体の希釈倍率は1000倍で、犬のMMP2が見られる位置は 62KDaと書かれているものと、72KDaと書かれているものがあり 混乱しています。。 どなたかご教授頂ければ幸いです。

横からすみません 削除/引用 No.1863-8 - 2008/09/19 (金) 20:10:11 - mom-a こねこさんの書き込みをみると、 ＞明らかにこの92kDaと62kDaの間にもマーカー(プロエンザイムとアクティブのようなバンド)のバンドが見えていて、ちょうどそこに検体のバンドが見えている状況です。 ＞分子量が62KDaと92KDaの間に見られるバンド(MMPマーカー)は、 2本でproMMP9とMMP9の2本のバンドのすぐ下に、見られます。 おそらくアーティファクトと考えられるのですが。。 まず、こねこさんがマーカーとして使っているMMPマーカーで見られているバンドが、正しいのかどうかはっきりさせるのが先決ではないでしょうか。 それが正しければ、その横に検体のバンドが見えているのだから問題ないような…。どのようなバンドが見えるか、メーカーに問い合わせてみましたか？ あだむやんさんからの下記の質問に対する明確な答えがまだのようですが…？ ＞それからそのもう１本？６２と９２の間に見えるバンドの分子量はいくらですか？ ＞とすれば、７２ｋＤであれば、proform ＭＭＰ−２だと思います。 ８４ｋＤであれば、active form ＭＭＰ−９だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1863-7 - 2008/09/19 (金) 02:41:02 - あだむやん > Albとマスクしてしまうというのは、MMP2とバンドがかぶり、Albの量が多すぎて、うまく白抜きバンドが見えないという事でしょうか？ はい、そういうことです。 さらに、MMP以外のなにかのバンドもたくさん見えることがあります。 > 以下がプロトコルなのですが、もしお気づきの点があればご教授頂ければ幸いです。 おおよそ問題ないと思います。 やはりなんらかの平滑筋細胞あるいは線維芽細胞をもちいてポジコンにしてみることをお勧めいたします。あまりお役に立てずにすいません。 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.1863-6 - 2008/09/17 (水) 11:47:00 - こねこ あだむやんさん 度々コメントを頂きまして、ありがとうございます。 ゲルについては、0.75�oの厚みで、1.5%gelatin 0.3mL を1枚分のゲル用に使っています。

(無題) 削除/引用 No.1863-5 - 2008/09/16 (火) 13:37:38 - こねこ 血液は、血清と血漿に分離し、PBSで25倍に希釈し、roadしています。 Albとマスクしてしまうというのは、MMP2とバンドがかぶり、Albの量が多すぎて、うまく白抜きバンドが見えないという事でしょうか？ 以下がプロトコルなのですが、もしお気づきの点があればご教授頂ければ幸いです。 Resolving gel HPLC-grade water 1.74ml 10%SDS 45μL 30%acrylamide-0.8%bisacrylamide 1.5mL 1.88M Tris 0.94mL 1.5%gelatin 0.3mL 10%ammonium peroxodisulfate (APS) 22μL N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine(TEMED) 4μL Stacking gel 30%acrylamide-0.8%bisacrylamide 500μL 1.25M Tris-HCl(pH6.8) 500μL 10%SDS 50μL HPLC-grade water 3.9mL 10% APS 25μL TEMED 6μL Reservoir buffer 10×electrode buffer 30mL 10%SDS 3mL 蒸留水　267mL 5×Sample buffer 125mM Tris-HCl(pH6.8) 4%SDS 20%グリセロール 　0.04%Bromophenol Blue SDS抽出緩衝液 　50mM Tris-HCl(pH7.5) 5mM CaCl2 1μM ZnCl2 2.5％(w/v)TritonX-100 Enzyme buffer 50mM Tris-HCl(pH7.5) 5mM CaCl2 1μM ZnCl2 CBB染色液[0.1％(w/v)CBBR-250,50%(w/v)メタノール,20%(w/v)酢酸] ＊StandardsforhumanMMP-2,9(0.1mg/ml)(CHEMICON)sample bufferで20倍希釈 1.Resolving gelの作成。ゼラチンは、45℃の恒温槽内で蒸留水中に溶かす。 2.Stacking gelの作成。Gelが固まったらwellを良く洗う。 3.サンプルを5×sample bufferと混合、タンパク量が10μgをroadする。 4.running bufferを注ぎ、氷冷下で、20mA/枚、90分間電気泳動する。 5.gelを、蒸留水でゆすぎ、SDS抽出緩衝液に浸して室温で45分間振盪する。 6．蒸留水でgelをよく洗浄する。(DWで1Ｌ使用) 7.Enzyme bufferの中で15〜24時間、37℃で振盪する。 8.gelを蒸留水で洗浄し、0.1％CBB染色液で15〜20分染色する。（室温、振盪。）その後蒸留水に浸して12時間以上振盪し、脱色を行う。

血液サンプル 削除/引用 No.1863-4 - 2008/09/13 (土) 12:42:21 - あだむやん 犬の検体は今まで扱ったことがないのでよくわかりません。お役に立てずすいません。 使用されているＭＭＰマーカーは犬のＭＭＰなのでしょうか。もしそうならばHumanに近いような印象を受けます。 とすれば、７２ｋＤであれば、proform ＭＭＰ−２だと思います。 ８４ｋＤであれば、active form ＭＭＰ−９だと思います。 ちょっと気になったのですが、犬の血液をＺｙｍｏに使用しているとのことですが、どのように処理されていますか？血漿中にアルブミンがあれば、分子量が６０ちょっとで、しかもバンドが極太にでるためＭＭＰ−２はマスクされると思います。 それからＺｙｍｏのloadingに関しては、低電圧あるいは低電流で長めに流すことをお勧めいたします。そのほうがバンドがきれいにわかれます。 あとは、ゼラチンの濃度とＧｅｌの厚み、タンパク質の量によってはバンドがみにくくなったり、Ｓｔａｉｎｉｎｇにコマシー以外のものを使っている場合は多少感度が悪くなったり、、、、 とりあえず、平滑筋細胞あるいはＦｉｂｒｏｂｌａｓｔにはＭＭＰ−２がたくさんありますから、それらを単離しポジコンとして使用されてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1863-3 - 2008/09/12 (金) 23:29:24 - こねこ あだむやんさん コメント頂きましてありがとうございます＞＜ 測定しているものは、犬の心筋をホモジしたもので、 10μgのタンパク量でroadしています。又、犬の血液も同じタンパク量で roadしています。 人の心臓病でMMP2と9が増える事が知られている事から、 僧房弁閉鎖不全症の犬の心筋と血液でMMP2と9を測定しています。 種によって分子量が違うとは知りませんでした。 何か犬の分子量を知る良い方法をご存知ないですか？？ 分子量が62KDaと92KDaの間に見られるバンド(MMPマーカー)は、 2本でproMMP9とMMP9の2本のバンドのすぐ下に、見られます。 おそらくアーティファクトと考えられるのですが。。 また、現在もMMP2の場所にサンプルではバンドが見られない状況です。 SDS抽出やEnzyme bufferの振とう時間を長めにしてみましたが、 MMP2のみバンドが見られません。

MMP2 削除/引用 No.1863-2 - 2008/09/06 (土) 04:43:05 - あだむやん MMPsは人とマウスで微妙に分子量が違います。どの種を使われていますか？あと、サンプルはなんでしょうか？タンパクですか？Mediumですか？それからそのもう１本？６２と９２の間に見えるバンドの分子量はいくらですか？

ゼラチンザイモグラフィーのMMP2のバンドについて 削除/引用 No.1863-1 - 2008/09/01 (月) 03:02:58 - こねこ 分子量マーカーを使って、一応大体の分子量の予想はつくのですが 全然関係ない所にマーカーが出てしまっていて・・ 検体の方はきれいに2本、白抜きバンドが出ているのですが 一つは分子量的に活性型MMP9で間違えなさそうなのですが、 もう一本はMMP2なのかと思いきや分子量的にMMP2ではなさそうなのです。 検体は心筋で、正常のものでもMMP2が発現する事がわかっているので MMP2現しないのはおかしいのです。 抗体の説明書には(Chemicon International/LOT:LV1362369) MMP9proenzyme:92kDa MMP2(activated form):62kDa と書いてあるのですが、明らかにこの92kDaと62kDaの間にもマーカー(プロエンザイムとアクティブのようなバンド)のバンドが見えていて、ちょうどそこに検体のバンドが見えている状況です。 どなたか、MMP2についてご教授下されば幸いです。 又もし使いやすいMMPのマーカーや、分子量マーカーがあれば 教えて頂きたいです。

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