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固定液は？ 削除/引用 No.1855-6 - 2008/09/01 (月) 10:55:36 - 千 皆さんスルーされてますが、固定液は何を使ってますか？ リンパ球マーカー系や表面免疫グロブリンなどは10％ホルマリン固定だと染まらないですよ。 新鮮凍結切片アセトン固定がおススメです。でなければ４％ＰＦＡ固定がいいです。 ちなみにうちのラボでは「4%PFA固定パラフィン切片をMASコートスライドに拾って55℃ O/Nで乾燥したものを、0.01Mクエン酸Buffer pH6.0で120℃ 5分のオートクレーブ賦活」がルーチンの条件になってます。 それと、賦活の条件や切片のはがれについては、古いBioTechnicalフォーラムでもいくつかトピックがあるので検索してみては？

(無題) 削除/引用 No.1855-5 - 2008/08/31 (日) 20:28:47 - mikan 私も初心者で、うまく切片が切れるようになってから、 けろろさんと同じ大失敗をしてしまいました！ いろいろな、プロトコール、濃度、温度などの 見直しがありましたが、一番の原因は結構単純で、 お湯から、シランコートのガラスに乗せるときに、 ガラスをお湯で温めながらゆっくり密着させ、 ガラスとパラフィン切片の間に入り込んだ 水をできるだけ振って落とすようにすると、 落ちにくくなりました。 お湯につけるとパラフィンのしわがきれいに伸びますが 私はのんびりつけすぎていてそれも原因でした。 私、ああ〜首になる〜。って言うほど大事なサンプルを 大量にダメにしてしまいましたが、なんとか皮一枚で 続いています。けろろ軍曹もがんばってください。

(無題) 削除/引用 No.1855-4 - 2008/08/31 (日) 19:11:10 - 組織 切片剥離について ・コートされたスライドグラスを使う ・切片をスライドグラスにひろった後、切片とガラスの間の水をよく切る ・念のため、37℃で1晩乾燥させる オートクレーブ条件は特に問題ないと思います。 CD抗原にはペルオキシダーゼブロックで失活するものがあります。その場合、ペルオキシダーゼブロックをスキップして、一次抗体の洗浄後に0.3%H2O2/メタノールで室温20分反応させます。 抗体はパラフィン切片に使えるものでしょうか？メーカーのデータシートや、文献を確認してください。 抗原賦活方法もいろいろ検討した方がいいかもしれません。抗原賦活なし、オートクレーブ/マイクロウェーブ、ProKやトリプシンなどの酵素処理、などを一通り試してみるのも手だと思います。 あと、よろしければ染色結果を詳しく教えてください。非特異もシグナルも出ないのか、非特異が強すぎてシグナルを判別できないのか、切片がぼろぼろすぎて何もわからないのか、剥がれていない部分ではシグナルが見えているのか、など、何かアイデアを出せるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1855-3 - 2008/08/31 (日) 18:44:21 - Fresh パラフィン切片の場合は、有機溶媒を通すのでその影響もあるかもしれません。 脂質を溶かすので、膜についているタンパク質が残りにくくなるのかも。 凍結切片にしてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1855-2 - 2008/08/31 (日) 18:38:07 - Fresh 将来的には、賦活化処理をしても標本がだめにならないノウハウをマスターしなければならないかも知れませんが、ここはまず、賦活化処理なしでやってみてはどうでしょうか。どんな場合でも必ずやらなければならない手順ではないですから。 むしろ、形態を犠牲にするリスクがあるので、やらなくてもエピトープが露出していて検出できるものであれば、やらないほうがいいことでして。 どちらの標的も膜タンパク質だと思いますが、膜タンパク質は抜けてしまいやすいので注意が必要です。まず、界面活性剤は溶液類から抜くか濃度を下げる、またはマイルドなものに変えます（サポニンなど）。熱をかけるのも膜タンパク質の溶出を引き起こす可能性があると思います。フォルマリン固定ではしっかり固定せず抜けてしまうことがあります。その場合はまずPLP固定を試してみることをお薦めします。

免疫組織染色 削除/引用 No.1855-1 - 2008/08/31 (日) 15:51:57 - ケロロ 免疫染色を始めて間もない初心者です。 CD4とCCR5とういう抗体をヒトの口腔組織で染色したい（パラフィン包埋）のですが、うまく染まりません。 染色された経験のある方、ご教授願いますでしょうか？ 方法は 脱パラ、脱水後 0.01molクエン酸Buffer　pH6.0を用いオートクレーブ121度、10分間、で賦活を行い、 1次抗体（over night）、2次抗体、DABをしています。 賦活液はクエン酸Naも試しましたが、同じようにうまくいきません。 抗体濃度や、賦活液の種類、ｐHも色々試しました。 また、オートクレーブのあと組織が剥がれ、ボロボロになっていることも多く、実験がなかなか進んでいません。 組織薄切後はお湯でシワを伸ばしたあと、ホットプレートを48度位にして置き、常温にした後翌日〜3日ほで使っています。 染色と剥離の2点についてよい方法はありますでしょうか

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