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(無題) 削除/引用 No.1853-8 - 2008/09/02 (火) 16:51:04 - リアリスト 仕事の性格にもよりますが、リン酸化特異抗体を用いたウェスタンの結果をもってAktの活性化としているような論文は沢山ありますよ。そこがネックになるような論文でなければ。

(無題) 削除/引用 No.1853-7 - 2008/09/02 (火) 13:39:40 - ats 生化学的な結果だけでなく、空間的配置／組織内局在をみるため、 1+2+リン酸化検出抗体（および通常抗体）での組織染色が望ましいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1853-6 - 2008/09/02 (火) 12:09:59 - おお >[Re:5] Aさんは書きました : > 皆様どうもありがとうございました。 > 1)こういった場合、リン酸化抗体で検出したシグナルの強さは、リン酸化活性の強さを表していると考えて良いのでしょうか? Aktのリン酸化活性を言いたいのですよね。 これは一概にそうとはいえないと思います。Aktが燐酸化されている事を示しているだけです。活性についてはこのアッセイでは図れませんので。ただ燐酸かと活性化の関係がどれだけ樹立しているかによって、活性化を示唆するデーターとしてのインパクトが変わってきます。細胞レベルの実験ではたいてい活性化しているとそれだけで言うと、不備を指摘される可能性がおおきいです。下流のGSKの燐酸かとか、おしめしの、キナーゼアッセイをした方がいいかとおもいます。 > > 2)そうでなければ、.......それが、この組織のもっているAktによるリン酸化力を表したものであると考えて良いのでしょうか? これは概ねいいかと思います。

ありがとうございました。 削除/引用 No.1853-5 - 2008/09/02 (火) 09:04:40 - A 皆様どうもありがとうございました。 漠然とした質問で申し訳ございませんでした。 私は、組織から蛋白を抽出し、Aktのリン酸化をみています。 現在、Thr308とSer473、両方のリン酸化抗体を用いて、ウェスタンブロットをしています。 1)こういった場合、リン酸化抗体で検出したシグナルの強さは、リン酸化活性の強さを表していると考えて良いのでしょうか? 2)そうでなければ、現在Cell　SignalingのAkt　Kinase　Assayを用いてAkt活性を見てみようと思います。こちらのキットの解釈は、AktのThr308、Ser473の両方を合わせたリン酸化活性を見ているものと解釈しています。それが、この組織のもっているAktによるリン酸化力を表したものであると考えて良いのでしょうか? 質問が良くないかもしれませんが、ご教示いただけたら助かります。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1853-4 - 2008/09/01 (月) 12:07:17 - ats 結果は同じように思われるかもしれませんが、その過程（実験手法／材料）をよく吟味すると、それぞれの方法の特徴／長所／短所が見えてきます。 簡単に質問せずにもう少し勉強してから、「〜だから〜」は正しいか否か？という質問の方が、有益なコメントがつきますし、ご自身の理解が深まります。

(無題) 削除/引用 No.1853-3 - 2008/09/01 (月) 10:31:06 - 小言幸兵衛 ウェスタンでリン酸化を認識する抗体を用いて「何を」評価するのかに依って答は違いますが。

(無題) 削除/引用 No.1853-2 - 2008/08/31 (日) 13:58:56 - おお >[Re:1] Aさんは書きました : > ウェスタンでリン酸化を認識する抗体を用いて評価することと、キナーゼアッセイを用いて活性を評価することの違いはあるのでしょうか？ 実験系がわかりませんので、おこたえすることが難しいですが、、、、 燐酸か抗体で、細胞からとったライセートをウエスタンするのであれば、細胞の実際の基質の燐酸化をみていますが、細胞のキナーゼによって加えた基質の燐酸かを見るのであれば、燐酸か活性(能力)を見ているだけで、、エンドの燐酸かの評価にはなりません。もしキナーゼアッセイでRIが使えないので代わりに抗体と考えていらっしゃるなら、理論的にはコンパチブルではないかと思いますが、定量性や、感度でRI (32PーATP)のほうが使い勝手がいいと思います。 抗体をその燐酸化部位特異的な物を使っているのであれば、クルードな系でもスペシフィックな活性を見れる可能性が高いです。あなたが考えているキナーゼか基質の複数の個所を燐酸かするのであれば(その燐酸化部位が)既に分かっているかいないかはおいといて、抗体が認識する以外の場所の燐酸かを見逃す可能性はありますし、RI(32P-ATP)では逆のことがいえると思います。 キナーゼアッセイとはどんなアッセイを考えているのでしょうか、、、、

リン酸化抗体による評価とキナーゼアッセイによる評価の違い 削除/引用 No.1853-1 - 2008/08/31 (日) 13:33:50 - A ウェスタンでリン酸化を認識する抗体を用いて評価することと、キナーゼアッセイを用いて活性を評価することの違いはあるのでしょうか？

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