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(無題) 削除/引用 No.1849-16 - 2008/08/31 (日) 22:34:58 - IRES >[Re:15] たんぱくさんは書きました : > 皆様、ご回答本当にありがとうございます。 > > 現在のPCR primerおよびrealtime PCRはヒト特異的なものを使用しています。 > なので、使用している細胞由来であると言うことは可能かと考えています。 > > 指摘された内容は、言われたときにおかしいと思って何回も確認しましたが、確かに「取り込まれたFCSに含まれるmRNAによる結果ではないか？」でした。その背景として、先ほども書きましたが、サイト名は忘れましたが、タンパクの発現が報告されている組織や細胞の名前が書いてあるサイトがあって、そこに私が使用している細胞の名前がなかったので、 > 「ここに無いから発現するはずがない」と言われた後の指摘でした。 > > 実際に、ネガティブコントロールとして、FCSだけでのデータを持っていなかったなど、不備な点が多々あったので、説得力に欠けたと反省しています。 > 皆様の意見を参考にして、指摘に対して反論するデータを提示できるように追加実験をしたいと思います。 いや、いずれにしてもかなりの難癖のように聞こえてしょうがないですね。 それとご質問の文章で、タンパク質、mRNA、遺伝子といった言葉が同義に扱われているように見えたり、異議だったりと言う感じで正直良く分からないです。一度、状況を整えてみていただけませんか？ 1.実験は...のように行い、...の結果を得た。 2.これに対して...のコメントが届いた。 と言う感じです。遺伝子名などは伏字やA,Bと言う感じで表記された方が良いかと思います。 この質問にコメントを寄せられている人が、全員共通の状況を想定していないので上手く結論がまとまっていないのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1849-15 - 2008/08/30 (土) 21:06:20 - たんぱく 皆様、ご回答本当にありがとうございます。 現在のPCR primerおよびrealtime PCRはヒト特異的なものを使用しています。 なので、使用している細胞由来であると言うことは可能かと考えています。 指摘された内容は、言われたときにおかしいと思って何回も確認しましたが、確かに「取り込まれたFCSに含まれるmRNAによる結果ではないか？」でした。その背景として、先ほども書きましたが、サイト名は忘れましたが、タンパクの発現が報告されている組織や細胞の名前が書いてあるサイトがあって、そこに私が使用している細胞の名前がなかったので、 「ここに無いから発現するはずがない」と言われた後の指摘でした。 実際に、ネガティブコントロールとして、FCSだけでのデータを持っていなかったなど、不備な点が多々あったので、説得力に欠けたと反省しています。 皆様の意見を参考にして、指摘に対して反論するデータを提示できるように追加実験をしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1849-14 - 2008/08/30 (土) 15:51:21 - AP ああ、なるほど。 RNAの存在量をRT-PCRで調べたと（これあってますか？）、で上昇しているという結果が得られたと。もしそうなら、まず事実としてそうと書かなければ。発現が促進されたというのは、その事実からの解釈です。 前置もなくいきなり「RNAの発現が促進された」と書かれてしまっては、それが事実から導かれた解釈ではなく、確立された事実そのものように取られてしまいます。 （この辺の、論理的な切り分けがぴんとこないようだと、いくら実験の手が動いてもScientistには向きませんよ） >FBSの細胞内への取り込みならびに回収時の残存FBSによる促進ではないかとの指摘をされました。 問題を指摘した人は 「RT-PCRの定量での増加=発現量の促進」であるとは必ずしも言えない。 それを示すためには、適当なコントロールが必要だろうということ言っているだけで、なにも難しいことじゃないですね。 残存FBSによる「促進」とは言っていなかったと思います。培地に存在するRNAまたはDNAのコンタミをPCRで殖やしたから、量が増えてるように見えてるんじゃないかということでしょう。 >無細胞環境で存在するタンパク質からmRNAは採取可能なのでしょうか？ PCRでポジティブになる程度は混じっていておかしくないです。 少なくとも本実験のスケールでは、培地からはPCRをしても増えてこないというコントロールを出せば済むことですね（もし出たら、今の結果の解釈が間違いか、実験系が不適当か、検討し直すとして）。結局、皆さんの指摘どおりの結論です。 私はまた、イチャモンに近い指摘をされて、「xx処理の実験から、〜〜は存在しない（または無関係である）ことが証明できました」と言っても、「それで本当に、完全に排除されていることが保証できるのか？」と悪魔の証明まがいの難癖をつけられているのかと思ってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.1849-11 - 2008/08/30 (土) 15:25:37 - sea 連投してすみません。 しちみさんのご指摘を見て自分が釈然としない理由を もう少し考えてみたのですが、最初の質問のところにある、 > 無細胞環境で存在するタンパク質からmRNAは採取可能なのでしょうか？ > 私の認識の範囲では、無細胞でのタンパクからmRNAは採取できないと信じてはいたんですが、指摘をされて疑問になり、質問しています。 という二つの文章と、その間に挟まれる下の文章、 > 培養時にFBSを使用し、さらにコラーゲンなどのコーティングディッシュを使用していますが、その遺伝子は血清中に大量に含まれているため、FBSの細胞内への取り込みならびに回収時の残存FBSによる促進ではないかとの指摘を は質問の内容が一致していないですよね。 多分この二つの質問がたんぱくさんの文章の中で入り乱れているので 読んでてよくわからなくなっちゃうのかな、と私は感じました。 タンパク質からmRNAが取れるかどうかと、血清にmRNAが含まれるかどうかは 同義じゃないですよね。

(無題) 削除/引用 No.1849-10 - 2008/08/30 (土) 15:08:54 - sea 「牛由来のmRNAがFBSに含まれていて、それを細胞が取り込んだものをPCRで 検出しているのではないか」 ということを聞かれている、ということでいいのでしょうか？ このように指摘された、と言うことなのか いまだになんか判然としないのです。 私は個人的にはおおさんが最初に書かれたご意見のままです。 それから、これはどのような形で「指摘」されたことで、 それに対してたんぱくさんがどれだけ時間と労力をかけて 指摘に対して対応する必要があるのかな、とちょっと思いました。 ちなみにmRNAだったら動物種が違えばそれぞれを区別するような primerをデザインするのはそんなに大変じゃないですよね。

(無題) 削除/引用 No.1849-9 - 2008/08/30 (土) 14:42:41 - しちみ 最初の質問で状況説明するのに、ご自身の判断や解釈が織り込まれているのでとても理解しづらいですね。 哺乳類の血清中にはある種のmRNAが存在すると聞いたことがあります。 血球に貯まってるのが壊れるときに出てくるんだったか．．．記憶があいまいで出典が明示できませんが、そういうことがあるらしいのでご自身が研究されている遺伝子がそれにあたるかどうかは調べる必要があると思います。 次にFCSにそれが残ってくるかどうかは、実際にFCSからRNA抽出して調べてみる必要があるでしょうね。 正解はAPさんのようにデノボ合成の証明でしょうけども、立ち上げが大変かもしれないのでFCSのRNase処理でいけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1849-8 - 2008/08/30 (土) 13:55:29 - AP そういうときは、培養条件でRNAなりタンパク質がde novoに合成されているということを示すのが正攻法ではないでしょうか。 たとえば、培養液中に放射性ラベルのヌクレオチド（放射性チミジン）やアミノ酸（35-S-Met）を添加して、抽出物に対して、coldのRNA probeでRNase protection assayをするとか、IPした産物に放射活性があることで、最初から存在したのではなくde novoに合成されたものであることを証明できませんか？ 詳しくは知りませんが、RIの使用に制限があるようでしたら、最近ではnon-RIの系もあったんじゃないかと思います（例えばBrU, Bioyin-Lysでラベルし抗体で検出など）。興味があればご自分でリサーチを。

(無題) 削除/引用 No.1849-7 - 2008/08/30 (土) 12:19:00 - おお >[Re:6] たんぱくさんは書きました : > おお　さん > > 抗体に関しては、データシート上ではhuman, mouse, rabbitのみとなっていますが、単にウシに関しては調べていないだけかもしれません。 お使いの血清でウエスタンして調べればいいのではないかと思いますが。 BSAが大量にあるので少し工夫がいつようかもしれませんが。 > 免疫染色などはいい方法かもしれません。 > ブレフェルジンなどで前処理した上で共焦点などでゴルジや小胞体で確認するのは無理ですよね・・・倍率的に。 お使いのレンズによるかと思いますが、、ゴルジ、ERのマーカーで分泌小胞が染まらないものであれば、共局在が示せたらいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1849-6 - 2008/08/30 (土) 11:57:34 - たんぱく おお　さん 抗体に関しては、データシート上ではhuman, mouse, rabbitのみとなっていますが、単にウシに関しては調べていないだけかもしれません。 免疫染色などはいい方法かもしれません。 ブレフェルジンなどで前処理した上で共焦点などでゴルジや小胞体で確認するのは無理ですよね・・・倍率的に。 もう少し検討してみたいと思います。 sumooo　さん 私が指摘されたのはその内容です。 細胞が無い状態でタンパクからmRNAへの変換は無いと信じていましたし、 おおさんからの指摘のようにFCS中にmRNAは含まれていないとは思うのですが・・・・ sumoooさんに指摘された方法で実際に示す方法がいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1849-5 - 2008/08/30 (土) 11:35:55 - sumooo すみません。 もしかしたら、的を外したことをいっているかもしれないので、 確認させてください。 たんぱくさんが言われているのはは、FCSにある牛由来のmRNAが細胞培養時に、目的の細胞に入り込み、それがPCRで検出されてしてしまっているということでよろしいでしょうか？ もし、そうであれば、いくつかそれが正しいか正しくないかコントロールをとることで検討することができるのではないかと思います。 1）他の細胞株で同様の実験をする。 2)FCS汁を用いて、目的の遺伝子の増幅がみられるか検討する。 へんなことをいうていたらすみません。

(無題) 削除/引用 No.1849-4 - 2008/08/30 (土) 10:58:09 - おお たしかに、培養している環境で周りにいっぱいあるタンパクと同等のものを細胞が作っているばあい証明が難しいですね。お使いの細胞が牛出ない場合、種の違いによりクロスしない抗体を探してみる。 または細胞を免疫染色して、ゴルジやER染色がみとめられる(この場合小胞輸送を止めるとクリアーになるかも)とかいう方法も取れるかもしれません。 などでしょうかすぐ思いつくのは、、、、

(無題) 削除/引用 No.1849-3 - 2008/08/30 (土) 10:37:34 - たんぱく おお　さん、ご指摘ありがとうございます。 私が実験した限りでは、使用している細胞はmRNAを発現しており、さらに刺激によってmRNAは上昇しました。 指摘された際に、このデータが血清の取り込みによるものである可能性があるので、一概にこの細胞が合成した（上昇させた）mRNAではないのでは？というものでした。 コラーゲンに関しても、コーティングされたものを回収時に一緒に集めたからでは？とも指摘されました。 タンパクに関しても、刺激により上昇していましたが、これに関しては取り込みによるものであると否定は出来ないので、mRNAの結果と合わせて、この細胞が発現している（刺激によって発現上昇している）と示唆するつもりでしたが、あまり納得してもらえなかったです。 実際には、使用している細胞がこのタンパク発現しているという報告がない（あまり調べられていないだけだと思いますが）ので、信用されていないだけかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1849-2 - 2008/08/30 (土) 10:21:28 - おお 何か勘違いをされているのではと思います。あなたの使っている細胞のmRNAの発現や発現上昇などを見ろということだと思います。血清にはmRNAは含まれませんからあなたのつかっている細胞由来のタンパクであることがmRNAを見ることで示唆できるということではないでしょうか。

mRNA発現の検討 削除/引用 No.1849-1 - 2008/08/30 (土) 10:06:33 - たんぱく いつも拝見し、勉強させていただいております。 単純な質問で申し訳ないのですが、 無細胞環境で存在するタンパク質からmRNAは採取可能なのでしょうか？ 現在、細胞がある刺激によって、ある遺伝子の発現を促進されるかを検討しています。 培養時にFBSを使用し、さらにコラーゲンなどのコーティングディッシュを使用していますが、その遺伝子は血清中に大量に含まれているため、FBSの細胞内への取り込みならびに回収時の残存FBSによる促進ではないかとの指摘をされました。コラーゲンに関しても、骨分化時にtype I Collagen mRNAでの検討に関しても指摘されました。 私の認識の範囲では、無細胞でのタンパクからmRNAは採取できないと信じてはいたんですが、指摘をされて疑問になり、質問しています。 ちなみに、この細胞は、無血清状態ではすぐに死んでしまうため、無血清での確認はできませんでした。 よろしくお願いいたします

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