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(無題) 削除/引用 No.1848-21 - 2008/09/10 (水) 10:23:51 - おお いまさらですが、お礼をしとかなくてはということで、IRESさん、devil's advocateさんありがとうございました。 >[Re:20] IRESさんは書きました : > 私もdevil's advocateさんとほぼ同意見ですが、Y2Hでポジであれば直接的結合であろうと想定しながら進めます。 たしかに、そういう想定でやると言うのが一般的のように思えますね。 >[Re:19] devil's advocateさんは書きました : > > 結合が直接であれ間接であれ、結合に必要な最小領域を同定することには意味があると思われますし、そうやって切り縮めたドメイン同士ならば最終証明のために組換え体タンパク質を大腸菌等で発現させるのも容易になることも期待できます。 そうですね。私も場所を絞ってからのほうが大腸菌でやりやすいという考えがありました。 > >また、上手い実験系を組めばランダムに断片化したコンストラクトを利用して、陽性クローンを選択することで結合領域を決めることも出来るかも知れません（ちょっと技に走りすぎですけど）。 面白そうなアイデアです。試薬やさんにキットでも作らせるといいかも、、、

(無題) 削除/引用 No.1848-20 - 2008/09/03 (水) 19:06:15 - IRES 私もdevil's advocateさんとほぼ同意見ですが、Y2Hでポジであれば直接的結合であろうと想定しながら進めます。私の場合は結合云々よりもそのコンプレックス形成のシグナル伝達における機能的意義について興味があるので、それ以上の検討はあまり行わないのが常です。ただ、結合実験をY2Hで終わらせるのではなく、どのみち結合領域と機能との関係を検討するのでY2Hである程度の領域を狭め、その部分のみの欠損変異体の機能解析を行うので、相方のendoタンパク質と変異体、野生型の結合性をco-IPで検討するところまで行います。

(無題) 削除/引用 No.1848-19 - 2008/09/03 (水) 17:32:52 - devil's advocate 酵母のしかも核内でホモログが橋渡しをしているというケースはそんなに多くないだろうということを前提に、結合が直接であることの証明を後廻しにしてY2Hでドメイン切り縮めの実験を行うことに賛成です。 結合が直接であれ間接であれ、結合に必要な最小領域を同定することには意味があると思われますし、そうやって切り縮めたドメイン同士ならば最終証明のために組換え体タンパク質を大腸菌等で発現させるのも容易になることも期待できます。 同じ事はタグを付加したコンストラクトをトランジェントに発現してco-IPすることでも行うことができますので、どちらを選ぶかは実験者がどちらに通暁しているかで決めて良いと思います。 この場合にY2Hを用いる場合のデメリットはこれまでの議論でもありましたのでわざわざ挙げませんが、メリットはin vivo homologous recombinationを用いれば、ライゲーションも大腸菌でのサブクローニングも無しで多数のコンストラクトを簡便に作製することができることでしょうか。また、上手い実験系を組めばランダムに断片化したコンストラクトを利用して、陽性クローンを選択することで結合領域を決めることも出来るかも知れません（ちょっと技に走りすぎですけど）。

(無題) 削除/引用 No.1848-18 - 2008/09/03 (水) 12:51:37 - おお >[Re:17] IRESさんは書きました : > > それともYeast内での結合が直接的なのか間接的なのかを明らかにしないまま進むことが問題とされているのか こちらに重きをおいた議論をしたいとおもってます。

(無題) 削除/引用 No.1848-17 - 2008/09/03 (水) 12:22:30 - IRES > ところで皆さん、また少し議論ができればいいかと思いますが、Y2Hでドメインダイセクションをして結合する場所を見つけようとする場合、直接的な結合を前提にすると思いますが、Co-IPでイミュノコンプレックに存在したという状況からY2Hを導入してポジとでた時点で、ドメインダイセクションで結合に関与するアミノ酸配列を探すというのはどう思われますか。まずはイースト内で間接的に結合している可能性を否定してからという方がスッキリしますが実際はそうでないですよね。 このご質問から想定される論点は少なくとも二つあるかと思います。例えば、これはY2Hに限ったことではありませんが、ダイセクションの結果Domain構造が保たれていない可能性を懸念されているのか、それともYeast内での結合が直接的なのか間接的なのかを明らかにしないまま進むことが問題とされているのかです。もう少し論点を絞っていただけると議論しやすいように思います。

(無題) 削除/引用 No.1848-16 - 2008/09/03 (水) 10:51:48 - おお みなさんありがとうございました。 devil's advocateさま >私は、トランジェント高発現のco-IPなら、BSAとβ-ガラクトシダーゼだって共沈させて見せると豪語しているラボメイトとも仕事をしたことがあります。 わたしも豪語できるかも、、、、とかすかに思います。そういう意味ではY2HはCo-IPのサポートデーターとして取っておくのも一つのてだと言えるわけですね。 たしかにそういう考え方もできます。 Yさま >co-IPが過剰発現の系か、内在性のを見てるのかで、ずいぶん違うと思います。結合を示すなら、内在性co-IPはどうしても見たいです。直接結合を示したければ他の方も書いておられるように、精製リコンビナント蛋白を用いたプルダウンなどでしょう。私もY2Hに進むのはちょっと不可解に思います。 私もY2Kに進むのはある程度展望をもたないかぎり、不可解に思います。 でも幾らか皆様のアドバイスからアイデアをもらったようにおもいます。 精製リコンビナントですが、これも微妙な実験です。活性を図れずただしいホールディングができているかを調べられないタンパクもあり、そういう状況で精製して直接的な結合が見られなかった場合結論が出ないでしょうし、条件を変えてもっと実験するべきなのか、直接の結合はしないと結論づけた方がいいのか判断できないと思います。ぎゃくにこれも過剰発現の実験とにていて、そこそこののうどでくっつけるということもできますし、生理的な濃度でないといわれれば、どのくらいの割合で正しくフォールディングしているか分からないと突っぱねることもある程度可能です。 Y2Hでポジなら、直接と発表はできないでしょうが、その可能性を考えてリコンビナントの実験ができると思いますし、Y2Hでネガなら直接という考えでの実験はとりあえず保留という判断材料になる可能性があるかなと思います。 ところで皆さん、また少し議論ができればいいかと思いますが、Y2Hでドメインダイセクションをして結合する場所を見つけようとする場合、直接的な結合を前提にすると思いますが、Co-IPでイミュノコンプレックに存在したという状況からY2Hを導入してポジとでた時点で、ドメインダイセクションで結合に関与するアミノ酸配列を探すというのはどう思われますか。まずはイースト内で間接的に結合している可能性を否定してからという方がスッキリしますが実際はそうでないですよね。

(無題) 削除/引用 No.1848-15 - 2008/09/02 (火) 03:28:23 - Y co-IPが過剰発現の系か、内在性のを見てるのかで、ずいぶん違うと思います。結合を示すなら、内在性co-IPはどうしても見たいです。直接結合を示したければ他の方も書いておられるように、精製リコンビナント蛋白を用いたプルダウンなどでしょう。私もY2Hに進むのはちょっと不可解に思います。

(無題) 削除/引用 No.1848-14 - 2008/09/01 (月) 15:57:36 - devil's advocate 私は、トランジェント高発現のco-IPなら、BSAとβ-ガラクトシダーゼだって共沈させて見せると豪語しているラボメイトとも仕事をしたことがあります。 程度を問わなければ、全てのタンパク質の組み合わせでなにがしかの相互作用はあるでしょうから、co-IPの結果は誰がやるかによって信頼度が違うというのが、実験に直接タッチしていないボスの心配事なんじゃないですか？ それに比べると、Y2Hは、同じプラスミド、同じホスト株、同じ選択プレートを使うかぎりは同じ結果が出るところが良いところで、ボスとしても安心して次のステップに進めると。

(無題) 削除/引用 No.1848-13 - 2008/09/01 (月) 08:49:25 - IRES > CO-IPできれば、多分直接なんていっている論文ってあるんですか、、、、ちょっと驚きです。レビューアーさんしっかりしてくださいよ、、、、 私もこれは意外でした。 これは流石に言いすぎだと思いますが(笑)。 二つのタンパク質の会合が直接的か間接的かを証明するのは両者のreconbinant proteinだけが存在する条件で証明する、さらに結合状態の結晶構造解析まで行わないといえないと思います。 しかし、これらを行うことはなかなか難しく、pull downまで証明していれば御の字かと...しかし大抵の条件下でのpull downでも完全な証明にはなりませんし、その点ではY2Hで直接的に結合している"可能性がある"というのと大差ないように思います。勿論ここまでの議論はco-IPでの証明もなされた上でのはなしですが。 思うにおおさんのBossがY2Hにこだわるのもこの辺りが理由なのかなと思いコメントさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.1848-12 - 2008/09/01 (月) 07:08:46 - おお >[Re:11] 信条的さんは書きました : > 我々はふつうCO-IPできれば、多分直接くっついてるということにしていますが、よくよく考えるといい加減な慣習です。小手先の叙述のテクニックとしては直接という言葉を避けるべきなのでしょう。 CO-IPできれば、多分直接なんていっている論文ってあるんですか、、、、ちょっと驚きです。レビューアーさんしっかりしてくださいよ、、、、

(無題) 削除/引用 No.1848-11 - 2008/09/01 (月) 06:37:56 - 信条的 >酵母内の核内タンパク質が哺乳類細胞AとBにどちらに対しても会合性を有し、しかもその間に入り込んで仲介する可能性ってどれほどあるのでしょう？ 分からないというのが答えでしょう。酵母でも保存されている蛋白群だとさらに分からない。さらに、２ｈは基本的にはそれだけでは信用されない。2-3重に分からないが重なると、サイエンスにならない。 かといって、IPでも、両方精製してやってるのはほとんどないですから、厳密にいうとこれも第三の因子の関与を否定できない。我々はふつうCO-IPできれば、多分直接くっついてるということにしていますが、よくよく考えるといい加減な慣習です。小手先の叙述のテクニックとしては直接という言葉を避けるべきなのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1848-10 - 2008/09/01 (月) 02:19:08 - おお あ、直接かどうかという議論がでてきましたね。この辺も意見を聞きたかったところです。マンマルの細胞でやるよりは直接的可能性が高いと思いますが、どうも間接的かも知れないというのをY2Hでは否定できないですよね。たとえばスプライシングにかかわる基本的なタンパクなんかはイーストのその遺伝子を欠損した株をレスキューしたりしますし(MAPKもそうですね)、スプライシングは核内で行われることを考えると、マンマルのタンパク同士でY2Hをやっても、なんかの(多分不完全な)コンプレックスを形成しているのではとおもってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.1848-9 - 2008/08/31 (日) 22:41:21 - IRES >[Re:8] IRESさんは書きました : >哺乳類細胞AとB... 哺乳類タンパク質の間違いです。

(無題) 削除/引用 No.1848-8 - 2008/08/31 (日) 22:13:25 - IRES >[Re:7] 信条的さんは書きました : > >Y2Hの場合、co-IPに比較して直接的にAとBが結合している可能性があると言うことを言ってもそれほど強く反発はされないかな？と言う印象です。 > > 第三の因子が酵母内で相互作用を仲介する場合があるのでこれは言えないと思います。 > > 直接の相互作用をいうなら、高度に精製した蛋白同士の結合を見る方法に限られると思います。 こういう批判はよく聞きます。それゆえ幾つかの条件をコメントにつけているのですが...それにしても、酵母内の核内タンパク質が哺乳類細胞AとBにどちらに対しても会合性を有し、しかもその間に入り込んで仲介する可能性ってどれほどあるのでしょう？そんなに頻繁にあるものなのですかねぇ...例えばWBで目的のバンドの位置にノンスペバンドが検出される可能性とどちらが高いのでしょうか？(笑)まぁ、後半は冗談です。

(無題) 削除/引用 No.1848-7 - 2008/08/31 (日) 20:59:58 - 信条的 >Y2Hの場合、co-IPに比較して直接的にAとBが結合している可能性があると言うことを言ってもそれほど強く反発はされないかな？と言う印象です。 第三の因子が酵母内で相互作用を仲介する場合があるのでこれは言えないと思います。 直接の相互作用をいうなら、高度に精製した蛋白同士の結合を見る方法に限られると思います。

(無題) 削除/引用 No.1848-6 - 2008/08/31 (日) 18:22:56 - IRES mammalのタンパク質AとBの相互作用がmammalian cellでのco-IPで検出できた場合、これはAとBが同じ複合体に入っている可能性がある。ということを示していると思います。これに対して、Y2Hの場合、co-IPに比較して直接的にAとBが結合している可能性があると言うことを言ってもそれほど強く反発はされないかな？と言う印象です。勿論、recombinant同士を用いたpull downやビアコアア等のほうが良いかと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1848-5 - 2008/08/31 (日) 12:05:54 - おお 皆さんありがとうございました。 IPで全長同士の相互作用がみれればY2Hのシステムはあまり導入の意味がないことが多いという点で、皆様の意見は一致しているように思います。 IPができないとか難しいいタンパクは確かに存在すると思います。核マトリクスのコンポーネントとか、中間径フィラメントとかもそういうのに入るような気がしますし。そういうタンパクであれば全長でなくてもY2Hを使う方がいいのかもしれませんね。 相互作用を担うドメインサーチには、従来の細胞に導入したのでは局在などの変化も起こりうるので、必ずしも細胞がいいと限らないという点は頷けますね。ただドメインがサーチできたとして、そのドメインの結合が細胞で起こっているか見るために細胞に戻らないといけないかもとも思うわけですが、、、、そこでひと工夫が必要かもしれません。 実はボスがY2H好きで、とにかくY2Kなんですよ、、、、わざわざIPしてポジなのにY2H、Y2Hと、、、、、どうしてそうなるのと言いたかったりします。

(無題) 削除/引用 No.1848-4 - 2008/08/31 (日) 09:12:59 - ats ２hybrid法、細胞内の局在がおかしくなるドメイン同士の相互作用を調べる、逆に相互作用するドメインの同定には有効かなと思います。 でも全長タンパク同士では、他の方の意見と同じ、IPと共局在の証明でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1848-3 - 2008/08/30 (土) 23:50:10 - りょう Co-IPと哺乳類細胞での共局在を免染で確認する方に進めます。 個人的な意見ですが、two-hyで相互作用示しても、Co-IPできるか？局在はどうなのか？という疑問が浮上しますから、two-hyはやらないです。 two-hyは、分子量の大きな蛋白の場合、全長をbaitにするのも困難かもしれません。 イメージとしてtwo-hyで相互作用したら「物理的な結合があったね」と言ってあげるだけで、biologicalなものとは思えません（Co-IPも強制発現でしょうから偽陽性を拾う可能性は勿論ありますが、局在・deletion mutantなどを加味していけば白黒付けられるでしょうし、最終的にはfunctionalかどうかを証明していくでしょうから、哺乳細胞系での発現ベクターを持っておくという意味でもtwo-hy抜きでいきます。 参考まで

(無題) 削除/引用 No.1848-2 - 2008/08/30 (土) 22:21:47 - 信条的 基本的にはIPの手法が優先されるので、IPで再現性よく実験できるなら、２−ハイブリッドはやらないです。私は。　　というか、論文審査で、２−ハイブリッドは相対的に弱い証拠として扱われるので、単純に危険ですね。 一方、IPできないけど、間接的に相互作用があると他の多くの証拠から認められる場合、２−ハイブリッドを使う場合がみられますね。 しかし、私はへそ曲がりなので、IPだってin vitroの要素が強く入っており、２−ハイブリッドを相対的に弱い証拠とするのも、いろいろ問題があると思っています。論文審査、実務的には、IP、信条的には２−ハイブリッドです（笑い）。

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