>[Re:5] うれあさんは書きました :
> ご返答ありがとうございました。
> 論文の情報が少なかったので、メールで筆者に質問したのですが、返答はなく、後は自分で試行錯誤という感じです。
> 論文にはタンパク量や遠心に関する記述がありません。
> 指摘の通り脂質が問題になるようでしたら、超遠心もしてみたいと思います。
超遠心はそっちのほうがいいかと思いますが、普通の遠心でもいいからやっておいた方がいいかと思います。ただし、あなたのターゲットがあグッていたりすると沈殿のほうにいってしまう可能性があります。
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> はじめは自分のタンパク質可溶化のプロトコールで界面活性剤はいろいろ試してみましたが、すべてだめで、結局論文通りの組成で行っています。
> はじめは尿素はサンプルだけで、ゲルには入れていませんでした。
> ゲルに尿素を入れたところ、ノンスペバンドですが、バンドが新たに出現したので、ゲルに入らずにアグってしまうタンパク質が意外に多いのではと思いました。
確認ですがゲルにはSDSが入っていますでしょうか?最近ではゲルにSDSが入ってなくても、電気えいどうそうのバッファーに入っていればたいていきれいにえいどうできるので、入れない方もいるようですが、疎水性の強い膜タンパクを扱っている場合はちょっと危険かとおもいました。
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> 免染では、検出できているようなので、おそらく可溶化の段階で、アグってゲルに入らないということを疑っています。
> （強烈に？）アグリ易いタンパク質を、アグらずに泳動するためには他（尿素入れる・ボイル&凍結しない）に工夫する点はありますでしょうか？
SDSなどの強力な界面活性剤を最初からかよう可するときに使ってみるとか、サルコシル(これも界面活性剤)などを使ってみるとかでしょうか、、、
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> 他にも膜タンパク質を検出しているのですが、ほとんどが検出できません。
> ほんと膜タンパク質はやっかいです。
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> あと、ゲルだけに尿素を入れると、泳動が乱れるようなので、泳動バッファーにも尿素を入れてもいいのでしょうか？
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膜タンパクだから検出できないと言うのはちょっと不思議です。容易に検出できるのもありますので。プレパレーション、えいどうとかに何か原因がありそうです。バッファーに尿素を入れるのはかまわないと思います。悪いことはしないとおもいます。 |
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