Bio Technical フォーラム

  • 書き込みがかなり増えてしまいサーバーの負荷が大きくなったので、新しいBioTechnicalフォーラムに移行してください。
  • 新しいトピックは新フォーラムでのみ立ち上げ可能です。レスは2009年2月15日までつけられますが、その後は、つけられません。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム（readのみ）　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

Annexin/PI染色について トピック削除
No.1828-TOPIC - 2008/08/26 (火) 21:42:24 - 非常に困ってます
　現在私はLNCaPやPC3の様な前立腺癌細胞株のアポトーシスを検出する系を立ち上げるために、新しくKit試薬を購入してAnnexin-FITC/PI染色を行っています。

　しかしながら、PC3はうまくいくのですが、なぜかLNCaPがアポトーシス誘導も行っていないのにPIが30-50％程度ポジティブになってしまいます。

　細胞自体の回収法は接着しているLNCaPを1mM EDTAと室温で反応させ、ピペットで回収した細胞をPBS(-)で2回洗浄しています。その後にAnnexin-FITCを反応させ、さらに2回洗った後の細胞をPI染色して直ちにFACSで流しています。細胞回収後の操作は極力氷上で行っています。
　AnnexinはネガティブなのでピペッティングやVortex等の操作上のストレスなりで細胞膜に穴が開いているのかと思ったのですが、強いピペッティングや泡立ちを避け、vortexを止めて遠心回転数を1000rpmに落としても全く解決できません。さらに、PI濃度を薄めても結果が変わらないので困ってしまっています。

　何か良い解決方法はあるのでしょうか。
　わかる方がいらっしゃいましたら何卒よろしくお願いいたします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.1828-8 - 2008/09/19 (金) 18:19:55 - DDD
>AnnexinはネガティブなのでピペッティングやVortex等の操作上のストレスなりで細胞膜に穴が開いているのかと思ったのですが

とのことですが、細胞膜に穴があくとAnnexin+になりますよ。

おそらくおっしゃられている通り、細胞の回収方法に問題があると思われます。扱い方についてはコメントできません。すいません。

(無題) 削除/引用
No.1828-7 - 2008/09/19 (金) 14:01:35 - 初心者マーク
DCさんにより

Annexin-VのPSへの結合は２価のイオン要求性らしく、EDTA入れたバッファーを使用すると染まりません。ご存じかとは思いますが・・・

それは勉強する時に見つかったの、そのためにAnnexin反応はいつもNegativeになったかも。

ありがとうございます 削除/引用
No.1828-6 - 2008/08/29 (金) 23:26:52 - 非常に困ってます
　返答が遅れてしまい申し訳ありません。
　皆さんのコメントに応じていくつか試験を行ってみました。

　PIの濃度は終濃度1ug/mlをTop concにして3倍希釈ずつ0.01ug/mlまで振りました。濃度の低下とともにPI+集団のFL2及びFL3のDensityも低下しましたが、最終的にPI+がPI-と合流する濃度0.03ug/mlでは、Actinomycin D処理でアポトーシス誘導した細胞でもPI染色が観察できませんでした。

　PI-の細胞集団がFL2とFL3の10E0〜10E1に丸く見えるようにvoltageを調整しているため、低下させると潰れて見えなくなってしまいました。この状態に至っても1ug/ml〜0.1ug/mlではPI+とPI-の集団は目に見えて分離していました。

　おおさんのご意見も試してみたかったのですが、蛍光顕微鏡が使用できなかったためトリパンブルーで染色を行ってみました。その結果20〜30％の細胞がトリパンブルーポジティブになっていました。

　この結果と上記の試験と合わせますとFACS側の問題ではないという結論で間違いないでしょうか。そうなると細胞回収の方法が悪いということになるのでしょうが、LNCaPとC4-2の回収法は特別な手法が必要になるのでしょうか。

　もしこれらの細胞回収法がわかる方がいらっしゃいましたらご意見をいただけるととても助かります。

　また、染色についてご意見を仰っていただいた方々、本当に言葉もないほど感謝しております。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1828-5 - 2008/08/29 (金) 13:44:23 - おお
１度PIで染めて、蛍光顕微鏡でみてみれば?核が染まってるとか確認もとれるとおもいますし。

(無題) 削除/引用
No.1828-4 - 2008/08/29 (金) 02:20:39 - sea
PIで染めていないネガコンはnegativeなんですよね？
PI濃度を薄めても変わらない、というのは、シフトは見られるが
positiveなままなのか、positiveなままシフトも見られないのか、
どっちなのでしょう？

(無題) 削除/引用
No.1828-3 - 2008/08/28 (木) 19:44:37 - うーん
DDDさん

横から失礼します。

>PI濃度を薄めても結果が変わらないので困ってしまっています。

うーん、PIの濃度を薄めても変わらないのであれば、濃度が問題ではないはず。

ただ単に、FL2の感度調節の問題なんじゃないでしょうか。

FL2のvoltageを下げて下さい。

それでapoptosis誘導させてFL2が右にシフトすればいいだけの話じゃないのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1828-2 - 2008/08/28 (木) 19:21:27 - DDD
PIの濃度を教えていただけますか？

Annexin/PI染色について 削除/引用
No.1828-1 - 2008/08/26 (火) 21:42:24 - 非常に困ってます
　現在私はLNCaPやPC3の様な前立腺癌細胞株のアポトーシスを検出する系を立ち上げるために、新しくKit試薬を購入してAnnexin-FITC/PI染色を行っています。

　しかしながら、PC3はうまくいくのですが、なぜかLNCaPがアポトーシス誘導も行っていないのにPIが30-50％程度ポジティブになってしまいます。

　細胞自体の回収法は接着しているLNCaPを1mM EDTAと室温で反応させ、ピペットで回収した細胞をPBS(-)で2回洗浄しています。その後にAnnexin-FITCを反応させ、さらに2回洗った後の細胞をPI染色して直ちにFACSで流しています。細胞回収後の操作は極力氷上で行っています。
　AnnexinはネガティブなのでピペッティングやVortex等の操作上のストレスなりで細胞膜に穴が開いているのかと思ったのですが、強いピペッティングや泡立ちを避け、vortexを止めて遠心回転数を1000rpmに落としても全く解決できません。さらに、PI濃度を薄めても結果が変わらないので困ってしまっています。

　何か良い解決方法はあるのでしょうか。
　わかる方がいらっしゃいましたら何卒よろしくお願いいたします。
全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を