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(無題) 削除/引用 No.1812-5 - 2008/08/25 (月) 00:17:19 - くるまど みなさまご回答ありがとうございます。 ＞株をいじるのが頭打ちになりそうであれば、培地や培養条件など他にいじるところがある 説明不足で申し訳ないです。 培地や培養条件はすでにある程度検討しました。代謝系と培地・培養条件をいじった結果、生産効率が頭打ちになったので取り込み系が問題になったのかな、と思っているところです。 ＞基質、中間産物、最終産物、すべての細胞内濃度を測定して反応速度論的に議論するべき そうですね。とりあえずセルフリーを取ってＨＰＬＣで細胞内濃度を測ってみたいと思います。 こういうときは普通は１３Ｃを用いるものなのでしょうか。検討したいと思います。 ＞やはり、発現してみるのがいい やっぱりトランスポーターをいじるのが直接的な感じがしますね。 ノックダウンや阻害物質を入れるなどの発想はなかったです。検討したいと思います。 みなさまのおかげで思いついたことが二つ。 １．取りこまれるが代謝されないような糖の誘導体を入れてみるのもいいかもしれませんね。それなら過剰発現による膜の流動性に与える影響とか関係ないし。 ２．セルフリーをとって基質と反応させてみて、細胞の培養結果と比較してみる。相当最終産物の生成速度が速くなれば、トランスポーターが律速であることが言えるような・・・ とにかく上と相談しながらいろいろ検討したいと思います。 また何かあればよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1812-4 - 2008/08/24 (日) 14:11:28 - おお やはり、発現してみるのがいいのではと思います。誘導がかかるプロモータで大量発現とまで行かないまでも、発現量を変えて、並行して産生量が動くようであれば、律速と厳密にいえるかどうか分かりませんが、考える余地が出てくると思います。逆にノックダウン(完全に近いKD出なくて半分ぐらいとか)でもいいかもしれません。ん、イーストはKDうまく行くのでしょうか、、、、 トランスポーターのタンパクを大量に発現するのでなくて、そのタンパクをネガティブに制御するような物からてをつけるてもありますね。あるいはそういうネガティブのシグナルに応答しない変異体を作るという方向もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1812-3 - 2008/08/24 (日) 00:54:19 - しちみ 反応経路の率速段階を決めたいのなら、基質、中間産物、最終産物、すべての細胞内濃度を測定して反応速度論的に議論するべきではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1812-2 - 2008/08/23 (土) 23:26:07 - ~ トランスポーターが律速であれば、 培地中のグルコース濃度を上げても、 生産速度は変わらないのでは？ 他にも影響が出てしまうかもしれませんが。 この研究の目的は、ある決められた培養条件下での生産性を高める変異体を作ることなのでしょうか？ 株をいじるのが頭打ちになりそうであれば、培地や培養条件など他にいじるところがあると思いますけど。

トランスポーターが律速になってることを証明する実験 削除/引用 No.1812-1 - 2008/08/23 (土) 20:14:03 - くるまど ある物質を効率よく生産できる遺伝子組み換え酵母を作製しています。 これまでは原料となる糖の代謝系の遺伝子に着目し、さまざまな株を作製してきましたがここに来てこれ以上生産効率があがらないのでは？と考えるようになりました。 現在は原料の糖のトランスポーター（取り込み系）が律速になっているのでは？と考えています。 そこで酵母のトランスポーターが代謝の律速因子になっていることを証明する実験を行いたいのですが、どういった実験系が考えられるでしょうか？ その糖のトランスポーターを大量発現させる方法では膜の流動性に悪影響（？）があるそうで何か他に方法がないか考えています。 よろしくお願いします。

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