BioTechnicalフォーラム [PCRによる点突然変異体作製時のテンプレート残存について]

(無題)

No.1811-2 - 2008/08/23 (土) 16:47:19 - ats

目的のバンドのゲル切り出しを行っても鋳型plasmidが極微量混入しているのだと思います。
PCR後の反応液に直接制限酵素DpnIを1unitほど加えて、37℃で30分ほど鋳型plasmid（に存在するメチル化GATC）を切断してください。それからゲル切り出し＞PNKを行ってください。
切り出したDNAが残っているのなら、PNK bufferとPNK,DpnIを加え、37℃で1時間、65℃で15分処理し、self-ligation反応を行えばよいでしょう。

PCRによる点突然変異体作製時のテンプレート残存について

削除/引用

No.1811-1 - 2008/08/23 (土) 16:01:29 - N

一般的な呼び名かどうか分かりませんが、tail to tail PCR（deletion mutantを作る際、ベクターに入った遺伝子の飛ばしたい領域の外側に、外向きに走るプライマーをデザインし、飛ばしたい領域以外の部分をベクターごと増幅するPCR）を行ない、PCR産物をself ligationさせる事により元の遺伝子のdeletion mutantを得ようとしているのですが、テンプレート由来のコロニーしか出なくて困っています。PCR自体はうまくいっており、目的の大きさにしっかりと濃いバンドが見られます。PCRはFINNZYMES社のPhusion Taqを使っています。目的のバンドのゲル切り出しも行ない、バンドが取れた事はもちろん確認しております。ライゲーション反応はタカラのMighty Mix (Code:6023)、またはT4 DNA ligaseにPNKを加えたもので16度over nightで行なっています。PCRまではうまくいっていると思うのですが、何故かほぼ100%、テンプレート由来のコロニーしか得られません。このような事は、扱う遺伝子を変えても同様に起こります。欲しい改変体が何も取れなくて非常に困っています。このようなご経験のある方や何かご存知の方がありましたらどんな小さな事でも結構ですのでお教え頂ければありがたいです。宜しくお願い致します。