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(無題) 削除/引用 No.1811-22 - 2008/10/18 (土) 13:43:56 - yt 成功されたようで良かったですね。 お役に立てて何よりです。 正直、教えた手前、こちらとしてもホッとしました。 原因は特定できないけれども何故かうまくいかないケースというのはあるので、 もしそういうのだったらどうしようかと心配してました。 今後の研究もうまく行くと良いですね。

(無題) 削除/引用 No.1811-21 - 2008/10/17 (金) 14:27:07 - N yt様 お教え頂いた方法でdeletion mutantを作製致しましたが、４つ平行して行なっていたもの全てが取れました！ deletionは24bpから482bpまで様々なものを行ないましたが、全部大丈夫でした。 私はいつも研究室で使っているPhusion TaqをPCRに使いましたが、問題なかったようです。プラスミドが環状になっている事を想像しておりましたのでバンドが見にくいのではないかと思いましたが、そんな事もなく綺麗に目的の大きさのバンドも見えました。Dpn1処理のみ行ないましたが、ゲル切り出し、ligationは必要なく、なんとも不思議ですね。プライマーの相補配列の位置をずらして複数の組み合わせを行ないましたが、組み合わせによっては目的の大きさのバンドが出てもテンプレート由来のコロニーしか得られない事もあるようですが、幾つかプライマーの組み合わせを作ればそれ自体はあまり大きな問題ではないようでした。 今までうまくいかなくて少し途方に暮れておりましたので、yt様からお教え頂いた事で本当に救われました。これからの私の非常に強力なツールになると思います。 insertion mutantの作製も行なっており、こちらも結果が楽しみです。 本当に本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1811-20 - 2008/09/29 (月) 17:16:54 - N yt様 貴重な情報を、どうもありがとうございます。 やはり5'端は結構自由に決められるのですね、いずれinsertion mutationもやりたいと考えておりましたので、さっそく参考にさせて頂きたいと思います。 point mutation作製にも大変便利ですね。 このやり方がものに出来れば、私にとって大変な前進になるので頑張りたいと思います。 細かいコツまでお教え頂き、大変助かりました。 deletion mutantのプライマーは早速注文致しました。 結果が今から楽しみです。 うまく出来ましたらまたこのトピックにてご報告できればと思っております。 本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1811-19 - 2008/09/29 (月) 15:36:42 - yt >２つ離れたpoint mutation 　 「同一ﾌﾟﾗｲﾏｰ上で少し距離を置いた２つのpoint mutation」という意味です

(無題) 削除/引用 No.1811-18 - 2008/09/29 (月) 15:33:34 - yt > また、お教え頂いた方法は部位指向性変異導入一般に言える事である、と >いう事は、例えばプライマーの相補配列の部分約15bpはどんな配列（変異を >導入したもの等）でも構わないという事でしょうか。。。一応それも私の方 >でやってみたいと考えておりますがお答え頂けますとと今後の私の実験に大 >変参考になります。何度もお聞きしてしまい大変恐縮です。 それはinsertion mutationを作るということでしょうか？だとすれば、もちろん可能です。 例えば、 5'-...TTTTAAAACCCCGGGGAAAACCCCGGGGTTTT...-3' に 5'-TTTTAAAACCCCGGGGatataattccggaattccggAAAACCCCGGGGTTTT...-3' というinsertionを作りたい場合は自分だったら 5'-ataattccggaattccggAAAACCCC...-3' 5'-ggaattccggaattatatCCCCGGGG...-3' という感じのﾌﾟﾗｲﾏｰを作ります。 テンプレートに相補的な部分（大文字部分）の長さは配列によりますが、自分はいつも長めにして最低でも18b以上にしてます。もし失敗して作り直す手間とカネを考えると、長いﾌﾟﾗｲﾏｰで成功率を上げた方が得だと思うので。 そういう主義なので、自分だったら2つ目のﾌﾟﾗｲﾏｰにすると思います。 まあ、1つ目でも大丈夫かも知れませんが。 もし、質問の意図が「ﾌﾟﾗｲﾏｰの鋳型に相補的な部分にpoint mutationを入れる」ということであれば、ﾌﾟﾗｲﾏｰが鋳型鎖に結合するのが妨げられない範囲で可能だと思います。普通は一つのpoint mutationを入れるなら、その部分を真ん中にして両方向に10-15bくらいずつのﾌﾟﾗｲﾏｰにすると思いますが、２つ離れたpoint mutationでもやったことはあります。3つ以上は試したことがありません。

本当にありがとうございます 削除/引用 No.1811-17 - 2008/09/29 (月) 10:57:11 - N yt様 大変分かりやすくご説明下さり、本当にありがとうございます。 プライマーの5'端と3'端で分けてTm値を考える事に思いつきませんでした。 今一度、yt様からご提案頂いたプライマーの一つ目のものを作ってみてチャレンジしたいと思います。 私もお教え頂いたwebページでTm値を見てみましたが、確かにセンスプライマーが5'端57.5度に対して3'端が36.0度というのは開き過ぎですし、3'端が36度にならないとくっつかないというのではPCRは苦しい気がしました。 また、大腸菌に事についてはPCRが走った場合にうちの系で出来るのだろうかと想像していて疑問が生まれたためお伺いさせて頂きました。実際PCRは全く走らず、バンドは未だ見られておりません。。。古い教科書に、相補的な配列をもつプライマーを使ったmutagenesisの方法が書いてありまして、そのプライマーによってできたPCR産物は両端にプライマーの相補配列をもち、その配列の所で大腸菌の相同組み替えが起こってプラスミドが環状になる、というような記載があったので、この度お教え頂いた方法も同様のメカニズムで出来るのかと考えたものでした。だとすると、大腸菌の中で相同組み替えが起こらなくてはならないが、私のもっている大腸菌はrecA(-)だから私の大腸菌ではできないのかなあと不安になってお伺いさせて頂いた次第でした。 しかし実際recA(-)でも出来るとの事ですので、yt様が仰るような相同組み替えではないメカニズムがあるのかもしれないですね。 また、お教え頂いた方法は部位指向性変異導入一般に言える事である、という事は、例えばプライマーの相補配列の部分約15bpはどんな配列（変異を導入したもの等）でも構わないという事でしょうか。。。一応それも私の方でやってみたいと考えておりますがお答え頂けますとと今後の私の実験に大変参考になります。何度もお聞きしてしまい大変恐縮です。 この度は本当に細かい所まで丁寧にご教授頂き、誠にありがとうございました。 早速プライマーを作り直してやってみます。 また、他のmutant用のプライマーもデザインしておりましたので、それらについて も5'端と3'端のTm値を確認してから実験に入りたいと思います。 yt様のお陰で安心して実験に入る事が出来そうで、これまでなかなかうまくいかなかった変異体作製にやっと光が見えてきた思いです。 またお伺いさせて頂く事があるかもしれませんが、どうぞよろしくお願い致します。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1811-16 - 2008/09/28 (日) 01:29:03 - yt I found an another mistake >ﾌﾟﾗｲﾏｰが相補的配列である鋳型鎖の3'端にアニールしてしまうのではないか I meant "5'-end" of the template. Sorry.

訂正 削除/引用 No.1811-15 - 2008/09/27 (土) 16:01:05 - yt ﾌﾟﾗｲﾏｰの話でわかりにくい表現をしてしまいました。 「前半」というのは3'側半分、「後半」は5'側半分ということです。

(無題) 削除/引用 No.1811-14 - 2008/09/27 (土) 15:54:32 - yt ところで、PCR産物を電気泳動でチェックはした上でPCRがかからないということでよかったのでしょうか？　コンピタント・セルの話が出てるので、transformationがうまくいかない可能性もあるかと思ったのですが。 primerのデザインの基本は良いと思うのですが、GC contentが前半と後半でかなり違うのが気になります。Fynnzyme社のwebsiteに丁度Tm計算機能があったので、前半と後半で別々に計算したら20℃以上違うようです。この場合のPCRではセンス・アンチセンスがそれぞれ、PCRの最初の方のサイクルでは前半部分のみでテンプレートに結合しなくてはいけないことを考えると大きいような気がします。もしかしたら、後半部分だけがテンプレートにくっ付いて前半がﾌﾟﾗﾌﾟﾗしてるような状態のﾌﾟﾗｲﾏｰが多いのかも知れません。 それと、私が昔読んだ部位指向性変異導入のマニュアルではﾌﾟﾗｲﾏｰの3'端はG or Cが好ましいと書いてましたので（あまり関係ないという意見もありますが）、上記のことも踏まえて、センスﾌﾟﾗｲﾏｰの前半部分を延長してみるのは一つの手かも知れません。 例えば 5'-gctgtggtggtctgc/tctagtgactacaaagacg-3' とか、思い切って 5'-gctgtggtggtctgc/tctagtgactacaaagacgatg-3' くらいに延ばしてみてはどうでしょうか？ ちなみにアンチセンスの方はいじらないでそのまま使えると思います。 　 2つ目の段落についてですが、deletionをつくる場合に限らず、一般に行われている部位指向性変異導入全般に言えることだと思います。自分も最初は同じような疑問を持ったのですが、実際にやってみるとうまくいくんですね。その仕組みがどうなってるのか見てきたわけではないので、あくまでも想像なのですが、変性して1本鎖になった鋳型鎖にﾌﾟﾗｲﾏｰが結合して伸長が始まって間も無く、ﾌﾟﾗｲﾏｰが相補的配列である鋳型鎖の3'端にアニールしてしまうのではないか？と思っています。ちょうど、ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞのself-ligationの反応が非常に効率良く起こるように、同一鎖内の相補配列ということで効率良くアニールするのではないかと。そのために１周してきたpolymeraseがﾌﾟﾗｲﾏｰの5'端にぶつかってそこで伸長が止まるのではないかと思っています。 あくまでも想像ですので、真に受けないで下さい。 自分としては、うまくいくのであればそれで良くて、仕組みをそれ程深く追求する気も無いので。

ご返答どうもありがとうございます 削除/引用 No.1811-13 - 2008/09/27 (土) 13:50:29 - N DDD様、yt様 ご返答下さり、誠にありがとうございます。 DDD様が仰るようなフラグメント化してPCRするやり方も検討したいと思います。in fusionなどのキットを使えば方向性も間違わないで出来そうです。私自身はこれまで、DDD様の仰る方法とは少し異なりますが、削除したい領域を挟んでベクターごとPCRしてライゲーションする方法をとってきました。しかし、このやり方ですと正確性の高い酵素をPCRで用いても何故か末端塩基が１つ、２つ落ちてしまったりで、何度やってもそれしかとれない事が多々ありまして、毎回泣かされておりました。ですので、yt様からお教え頂いたような相補的な配列をもったプライマーを設定すればそういう事も減るかなあと思って（片方が一塩基落としてももう片方にはその配列が残っているので。。。）始めた次第でした。 yt様には何度もお世話になってしまい申し訳ございません。 私が書きました、「実際テンプレート自体にはプライマーと完全に合致する配列はなく」というのは、削除領域を挟んだプライマー設定となるので、削除したい領域を含んでいるテンプレートと、これを含まないプライマーの相同性（？）が下がるのではないかなあと思って書きました。一方、プライマー同士は100%相補的な配列ですのでテンプレートとよりもプライマー同士の方がくっつきやすいのではないかと想像しました。 それから、相同組み替えについてなのですが、これが大腸菌で起こらないとしますと、PCR産物の両端に（計２つ）あるプライマーの相同領域が二重にだぶってくっついてしまうような事はないのでしょうか。。。私の中で正しいイメージが出来ていないのかもしれませんが、相同領域が付着端のようになると考えるとそこは一本鎖DNAでなければならないと思われて、通常のPCRで二本鎖DNAになる事を考えると難しい事のように感じてしまいましたのでお聞き致しました。通常ですと相同領域を両端にもったPCR産物が出来てしまうはずであると想像致しました。付着端を作る為に何か特別な処理が必要なのでしょうか。 これについてまたご教授頂けますと大変ありがたく存じます。 また、実際の配列とプライマー設定についてなのですが、462bpの削除を検討していまして、 標的部位の前後50bpのcDNA配列は 5'-tggtgcttgtcctcctgctgctgctgggctgtgctgctgtggtggtctgc/462bp/tctagtga ctacaaagacgatgacgataaatgagcggccgctcgagtctaga-3' であり、私は462bpの両脇の15bpをそのままプライマー配列に設定いたしました。 実際のプライマー配列は、互いに相補的で、 5'-gctgtggtggtctgc/tctagtgactacaaa-3' 5'-tttgtagtcactaga/gcagaccaccacagc-3' と作りました。 このようなやり方でやったのですが、何か根本的におかしい事をしているようでしたらご指摘頂けると大変助かります。 出来れば同じやり方で他のdeletion mutantも（これよりも長い配列を削除するものも含めて）作りたいと思っております。 理解が悪くいろいろとお聞きしてしまい、大変恐縮ですがどうぞよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1811-12 - 2008/09/27 (土) 04:41:44 - yt >[Re:10] Nさんは書きました : > 一つ目は、PCR自体についてなのですが、アニーリング温度、テンプレート >量、DMSOを加える等の条件を振ってみましたがPCRがどうしてもかかりませ >ん。実際テンプレート自体にはプライマーと完全に合致する配列はなく、ど>うしてもプライマーダイマーの方が先に出来てしまいます。 「実際テンプレート自体にはプライマーと完全に合致する配列はなく」というのはどういうことでしょうか？　ﾌﾟﾗｲﾏｰはテンプレートを元に設計するものだと思うので、この文の意図するところがよく理解できません。 >適したTaqなどがありましたらお教えいただけると大変ありがたいです。ち >なみに私が現在使っているTaqはFINNZYMES社のPhusion Taqです。 わたしはTaqではなくてPfu UltraII（？だったと思います）を主に使っています。合成速度が速いのでPCR時間も短くて済みます。 > 二つ目は、使用する大腸菌についてです。お教えいただいた方法ですとPCR >産物は両脇にプライマーの相同領域をもったものが増幅されてくると思いま >す。これをそのまま大腸菌にトランスフォームすると、大腸菌の中で相同組 >み替えとライゲーションが起こって環状になると想像しました。ここでなの >ですが、通常よく使われるXL1-BlueやDH5aなどの大腸菌はrecA(-)で相同組 >み替えは起こらない事になっています。ですのでこれらの大腸菌はこのやり >方では使えないのだろうかと考えましたが、そうなのでしょうか。 わたしはいつもXL10-Goldを使っていますが、これもXL1-Blueと同様にrecA-なのでコンピタント・セルの性質は関係ないと思われます。recombinationと言うよりも、ﾌﾟﾗｲﾏｰ同士が（制限酵素で切った後に出来るような）「付着端」となると思われるので組み替えとは異なると思われます。 宜しければ、（メールでもﾚｽでも良いのですが）ﾌﾟﾗｲﾏｰと削除したい領域の前後のテンプレートの配列を教えてもらえれば、より適切なアドバイスが出来ると思います。

これではダメなのでしょうか？ 削除/引用 No.1811-11 - 2008/09/26 (金) 23:38:11 - DDD 5'-ACGTACGTXXXXXXXXXXXXXCCCCGGGG-3' 3'-TGCATGCAZZZZZZZZZZZZZGGGGCCCC-5' deletionした部分を挟んで上流と下流にわけ 上流--------下流 上流部分だけでPCR 下流部分だけでPCR を行いfragmentをリン酸化し、three ligationという手はどうでしょうか？

使用する大腸菌について 削除/引用 No.1811-10 - 2008/09/26 (金) 22:48:22 - N 先日はこのトピックで大変お世話になりました。このトピックでyt様からお教えいただいた方法でdeletion mutantを作製しようと思い、deletion したい領域を挟んだ配列でプライマーを作りました。ここで、二つ程気になった事があり、またこのトピックにて投稿させて頂きました。 一つ目は、PCR自体についてなのですが、アニーリング温度、テンプレート量、DMSOを加える等の条件を振ってみましたがPCRがどうしてもかかりません。実際テンプレート自体にはプライマーと完全に合致する配列はなく、どうしてもプライマーダイマーの方が先に出来てしまいます。何かコツのようなもの、適したTaqなどがありましたらお教えいただけると大変ありがたいです。ちなみに私が現在使っているTaqはFINNZYMES社のPhusion Taqです。 二つ目は、使用する大腸菌についてです。お教えいただいた方法ですとPCR産物は両脇にプライマーの相同領域をもったものが増幅されてくると思います。これをそのまま大腸菌にトランスフォームすると、大腸菌の中で相同組み替えとライゲーションが起こって環状になると想像しました。ここでなのですが、通常よく使われるXL1-BlueやDH5aなどの大腸菌はrecA(-)で相同組み替えは起こらない事になっています。ですのでこれらの大腸菌はこのやり方では使えないのだろうかと考えましたが、そうなのでしょうか。このdeletion mutagenesisをされる際に適した大腸菌などが特別にありましたら是非ともお教えいただきたいと思い投稿させて頂きました。 プラッシー様にこのトピックでお教えいただいたニックが二つ入った状況と、上でお書きした 相同組み替えの事が混乱してしまっているのかもしれなく、恐縮ですがよろしくお願い致します。 以上長くなり恐縮ですが、yt様やプラッシー様がご覧頂ければ幸いですが、どなたかこれについてご存知の方がいらっしゃったらお教えいただけると大変ありがたいです。 どうぞよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1811-9 - 2008/08/27 (水) 08:30:43 - N yt様、プラッシー様 貴重な体験談と分かりやすいご説明をありがとうございました。 メカニズムも分かって、大変助かりました。 お教え頂いた方法で、懸案だったmutant作製をまた再開したいと思っております。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1811-8 - 2008/08/25 (月) 20:38:56 - プラッシー 産物はニックが２箇所に入った分子で、ちょっと考えればこれはCIAP処理したベクターにインサートをライゲーションしたのと同じ形であることが分かると思います。ライゲーションは大腸菌内で大腸菌の修復システムによって行われます。

(無題) 削除/引用 No.1811-7 - 2008/08/25 (月) 19:51:42 - yt 原理的には何bでもいけると思います。 個人的には約50残基（150b）程度のdeletionを作ったことがありますが、もっと長くても大丈夫だと思います。 　 不勉強で具体的にどういうメカニズムになってるのかは知りませんが、ligationは一般のsite-directed mutagenesisの場合と同じで、コンピタント・セルの中の酵素によって行われるのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1811-6 - 2008/08/25 (月) 10:31:59 - N yt様 アドバイスをどうもありがとうございます。 yt様のプロトコールでお聞きしたい事があるのですが、 この方法ですと手応えとして大体何ベース位までのdeletionが可能でしょうか。 私は現在24塩基（8アミノ酸）のdeletionを試みているのですが、この位の塩基数はやはり大きすぎて難しいものでしょうか。 感覚的に、あまり大きい領域のdeletionは難しいかとも思いますが、どの辺まで可能なものなのかお教え頂ければありがたいです。 また、おそらく大変初歩的なご質問で恐縮なのですが、 PCRの際、最後に３’末端に塩基がついた後、すぐ前に予めついている塩基（PCRのスタート地点となる塩基）との連結はTaqによって行なわれるのでしょうか。。。DNAリガーゼか何かPCR反応液に予め加えたりするのでしょうか。 いろいろとお聞きしてしまい申し訳ございませんが、いろいろな方法を知っておきたいと思いましたのでどうぞ宜しくお願い致します。

訂正 削除/引用 No.1811-5 - 2008/08/25 (月) 09:06:56 - yt ﾌﾟﾗｲﾏｰの部分を間違えました sense primer: 5'-ACGTACGTCCCCGGGG-3' anti-sense　: 5'-CCCCGGGGAGCTAGCT-3' 　 です。

(無題) 削除/引用 No.1811-4 - 2008/08/25 (月) 09:04:56 - yt 済みのところ余計なお世話かも知れませんが参考までに。 　 5'-ACGTACGTXXXXXXXXXXXXXCCCCGGGG-3' 3'-TGCATGCAZZZZZZZZZZZZZGGGGCCCC-5' 　 の配列でXXXXXXXXのところをdeleteしたい場合は 　 sense primer: 5'-ACGTACGTCCCCGGGG-3' anti-sense: 3'-TGCATGCAGGGGCCCC-3' （これはあくまでも例であって、実際には削除の前後15bpくらいずつが無難でしょう） としてsite-directed mutagenesisしてPCR産物をDpnIで処理して（templateを切断）それをコンピタント・セルにtransformすればgel extractionもligationも必要ないですよ。

(無題) 削除/引用 No.1811-3 - 2008/08/23 (土) 17:50:23 - N ats様 Dpn1という酵素は使った事がなく、恥ずかしながら知りませんでした。 八方ふさがりになっておりましたので大変助かりました。 NEB社に見つけましたので是非購入して検討させて頂きたいと思います。 本当にありがとうございました。

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