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(無題) 削除/引用 No.1808-5 - 2008/08/22 (金) 15:46:08 - ノックアウト屋 ということは、やはり早くvectorを作り直した方がよさそうですね。 頑張ります。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1808-4 - 2008/08/22 (金) 08:38:21 - 通りすがり 168コロニーであたりが4個とはかなり組換え効率が高いですね。 詳細な解析をしたことがないので、真実かどうかは分かりませんが、直感的には後者のような気がします。 やはり少しでも早くKOマウスを作るためにはloxP配列とNeoが近いベクターを作り直すとともに、平行してESスクリーニングを行うのがベストだと思います。 頑張って下さい！

(無題) 削除/引用 No.1808-3 - 2008/08/21 (木) 21:07:20 - ノックアウト屋 通りすがり様、ありがとうございます。 なるほど。hot spotがある可能性を考えると、loxPをNeoに近づけた方がよさそうですね。 ESのスクリーニングは、168 colonyをスクリーニングして、4個組み換えが起こっているのを確認しました。その中でloxPを持っているものはありませんでした。 もちろん、もう一度スクリーニングを行うことも並行しようとは思っています。 しかし、loxPの持ち込みに関して、次の2つの考え方があると思うのですが、後者の場合、このまま続けても絶望的な気がしてきたのです。 1. long arm全体がgenomeにペタリとくっつき、その後にlong arm内の1点で組み換えが起こる。この場合、loxPがgenomeに組み込まれる確率はloxPより近位のarmの長さと遠位のarmの長さの比に単純に比例しそうです。 2. loxPまでのlong armはNeoの延長とみなされ、loxPがgenomeに組み込まれる場合、loxPよりも3'側のarmの長さに依存する。この場合、今回の例ではarmの長さがわずか3kbとなってしまい、組み換えが起こる確率は非常に低いと思われます。 基本的に、どちらの考え方でいれば良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1808-2 - 2008/08/21 (木) 19:43:47 - 通りすがり 組換えのhot spotがlong armのloxPとNeoの間にある可能性があるので、私ならloxP配列をNeo側に近づけます。 ただ、再度ESのスクリーニングをしたらちゃんとしたクローンが取れる可能性もあると思うのですが。 ESのスクリーニングは1回だけですか？ あたりのクローンは何個取れました？

loxPを持ち込む組み換えが起こらない 削除/引用 No.1808-1 - 2008/08/21 (木) 19:07:32 - ノックアウト屋 ある遺伝子のconditional KOの作成を試みています。 targeting vectorは、short arm (2.5kb)-loxP-FRT-LacZ-Neo-FRT-long arm (7.5kb)-DTとなっており、全長約20kbです。 long armの中にloxPを挿入しているのですが、この位置はNeoから4.5kb離れています。 ESにtargetingを行いますと、サザンブロッティングにより組み換え自体は確認できるのですが、long arm内のloxPをgenomeに持ち込んでくれません。 恐らく、Neoとlong arm内loxPの間で組み換えが起こっているためだと考えているのですが、このような場合、次の解決法が考えられると思います。 1. long arm内のloxPをNeoから1.5kb程度まで近づける 2. long armを3'方向に伸ばし、12kb程度にする 皆様はこのような場合どちらを選択されますでしょうか？ よろしくお願いいたします

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