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(無題) 削除/引用 No.1805-4 - 2008/08/21 (木) 18:38:11 - 平研究員 何度か既出の話題です。「スキムミルク」をキーワードに検索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.1805-3 - 2008/08/21 (木) 18:07:27 - IRES 大抵はスキムミルクで大丈夫です。 私はメンブレンのブロッキングはスキムミルクにして1次抗体希釈液は5%BSA-TBST、二次抗体はメンブレンのブロッキング液でやっています。 ただ、phospho-serineが絡む場合はスキムミルクにはphospho-serine修飾を受けたタンパク質(名前を忘れました)が豊富に含まれているので真っ黒になりますのでBSAを使うと良いかと思います。ご指摘の製品がBSAよりも良いのかどうかは使ったことがないので分りません。

(無題) 削除/引用 No.1805-2 - 2008/08/21 (木) 16:18:37 - あや 私は、普通に、他のウエスタンと同様に、雪印のスキムミルクを使ってます。きちんと出ますよ。 私はリン酸化ＩｋａｐｐａＢを検出してます。

ウェスタンブロットによるリン酸化蛋白質の検出 削除/引用 No.1805-1 - 2008/08/21 (木) 16:14:26 - リンさん リン酸化蛋白質の抗体を用いて、タンパクのリン酸化をウェスタンブロットで検出する場合のブロッキングについての質問です。 リン酸化タンパク用のブロッキング剤として、PhosphoBLOCKERなるものがCELL BIOLABS社から出てますよね。私ははじめにこれを使うように言われて以来、リン酸化タンパクの検出の際はブロッキング、抗体反応(一次、二次とも)に5%PhosphoBLOCKERを使っています。これを使って実験自体はうまくいっているのですが、いまいちどういう仕組みでリン酸化タンパクの検出を助けているのかよく分からないし、何より高いので、スキムミルクとかBSAに替えられないだろうか・・・と考えているのですが、どなたかご意見いただけないでしょうか？ 普通のブロッキング剤ではでないのがこれだとくっきり出る、とか、高い金出して買うほどの効果はないとか、実際使ってる方の印象を聞きたいです。 あと、このブロッキング剤の原理に詳しい方もアドバイスください。商品にはリン酸化された部分を保護する、みたいな説明がありましたが、脱リン酸化を防ぐ（そもそもSDSとボイルで変性させてメンブレンにブロットしたタンパクが、その後脱リン酸化を受けるものなのでしょうか？）という意味なのか、リン酸化された部分をブロックしにくいような組成にしてあるのか・・・いずれにしても二次抗体の反応までPhosphoBLOCKERを使う必要はないんじゃないか？と思うのですが。

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