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ありがとうございます。 削除/引用 No.1804-5 - 2008/08/21 (木) 16:52:04 - TORU 早速のアドバイス、皆さんありがとうございます。 やってみる価値はありそうなのでとりあえず、アドバイス通りにPrimerを頼んで挑戦してみたいと思います。 駄目だったときはおおさんのアドバイスを参考にNested PCRも検討したいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1804-4 - 2008/08/21 (木) 16:46:16 - 弘法 酵母のノックアウトでは、ルーチンで60nt（うちアニールするのは3'側の20ntのみ）のプライマーを用いたPCRをやります。アニーリングの温度に迷うところですが、最初の10サイクルを20nt相当の温度で、あとの20サイクルをさらに高温でやったりしています（あまり意味がないかも）。ただし、TaqやExTaqだと良く増えるのですが、high fidelityの酵素を使うと増えにくいことを経験しています。

(無題) 削除/引用 No.1804-3 - 2008/08/21 (木) 15:37:01 - おお どれくらい難しくなるかとか分からないですが、できることも結構あると思います。むかし、100bpとかもっと長いPCRフラグメントを片側のプライマーとして使う(メガプライマーとかよんでたとおもう、もう片方はフツウノプライマー)方法でミュウテーションを導入したりというのをよくやっていたようです。 もしうまく行かないなら、そのプライマーで最小限にPCRをまわして、付加したい40merの5'から普通のプライマーを設計したプライマーを使いネストでかける手もあります。

(無題) 削除/引用 No.1804-2 - 2008/08/21 (木) 14:40:26 - ~ 40mer付加ならやったことがあります。 もともとの20merと同じアニーリング温度で増やせました。

Primer設計 削除/引用 No.1804-1 - 2008/08/21 (木) 14:31:17 - TORU クローニング初心者です。 すでにpcDNAに挿入されている遺伝子の5'側に40baseくらいのUTR配列を付加させたいと考えています。 sense側のPrimerを付加するUTR配列＋既存の挿入遺伝子の配列20baseくらい、計60base位のものを設計して、通常のPCRで増やせる物なのでしょうか？ 制限酵素サイトとか10base程度なら問題なく増えるかと思いますが40baseともなるとアニールしてくれるかわからないのでどなたかアドバイスお願いします。 宜しくお願いします。

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