BioTechnicalフォーラム [IP→二次元電気泳動]

IP→二次元電気泳動

No.18-TOPIC - 2007/08/01 (水) 09:54:21 - 困ったちゃん

お世話になっております。

IPしたサンプルを二次元電気泳動で解析したいのですが、protein A/G-sepharose に８Ｍ Urea入りバッファーを加えて変性すれば、sepharose に結合している抗体等のタンパク質ははがれるのでしょうか？

よろしくお願いします。
　

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No.18-11 - 2008/11/11 (火) 14:08:51 - 名無しさん

６ないし８Mと書きましたが、差し支えなければ念のため８Ｍでやってください。万一溶出できない（私は経験ありませんが、蛋白質なので何が起こるかわからないので。）ことも考えて、溶出が確認されるまでは溶出後のビーズは－２０Ｃで取っておいた方が賢明かと思います。溶出の成否は２次元までなくても通常の１次元SDSPAGE/WBで溶出液と溶出後ビーズのＳＤＳけんだく液でチェックできると思います。溶出液の方に抗原蛋白質が十分多ければＯＫです。一回確かめればこうした確認は次からは必要ありません。

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No.18-10 - 2008/11/11 (火) 13:37:38 - のら

>名無しさん
ありがとうございます！

6-8M urea,DTTの入ったサンプル処理液で処理すれば、10分くらいでビーズから離れるのですね。

>100KDaくらいに変なシグナル
S-Sが完全に切れないことが原因なのですね。

ありがとうございました！
安心して実験をすすめられそうです。

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No.18-9 - 2008/11/10 (月) 19:30:49 - 名無しさん

6-8M urea,DTTを含むサンプル処理液にけんだくすれば、加熱しなくても常温で10分も置けば大抵の蛋白質は変性しますのでそれだけで溶出できるはずです。このときDTTはなくてもＯＫでしょう。尿素は加熱するとｐＨ上がったり、側鎖のカルバミル化などによる等電点のアーティファクトの原因になるなどいいことないので普通しません。DTTも熱には弱いです。
ＩｇＧのＳ－Ｓが完全に切れなくて50K20Kの他に70KDaとか100KDaくらいに変なシグナルが出ることがありますので、抗原がこの辺の分子量をもつものは間違えないように気をつけましょう。

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No.18-8 - 2008/11/10 (月) 18:54:27 - のら

>よっしーさん、EcoRIさん、おおさん、
ありがとうございました！

酸性bufferを用いて溶出し、
Ureaの入ったbufferに置換すれば、加熱しなくても、
ビーズから溶出させてサンプルをつくることができるのですね。
悩みが解消しました。
早速実験をすすめたいと思います！

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No.18-7 - 2008/11/10 (月) 17:08:29 - おお

>[Re:4] のらさんは書きました :
> 私も同じことで悩んでおります。
> Urea添加後は加熱すると、Ureaが水解するので加熱してはいけないとtextには書いてあります。
> 加熱しなければ離れないとすれば、どのようにすればよいのでしょうか？

過熱しなくても大丈夫だと思うけどなあ。
過熱をするのはジスルフィド結合の解離を確実にするためだと思います。

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No.18-6 - 2008/11/10 (月) 16:17:48 - EcoRI

酸性のバッファーで溶出したら、
TCA沈殿などを行って、尿素ベースのサンプルバッファーへの置換が必要かと思います。

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No.18-5 - 2008/11/10 (月) 15:47:17 - よっしー

酸性のバッファーで(pH3程度)で溶出すると思います．

ほりかえしてすみません

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No.18-4 - 2008/11/10 (月) 15:15:30 - のら

私も同じことで悩んでおります。
Urea添加後は加熱すると、Ureaが水解するので加熱してはいけないとtextには書いてあります。
加熱しなければ離れないとすれば、どのようにすればよいのでしょうか？
あるいは、加熱してUreaが水解して
も問題ないのでしょうか？