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(無題) 削除/引用 No.1799-3 - 2008/08/21 (木) 13:43:56 - Ｋ ご回答ありがとうございます。 ＞この免疫染色に用いた抗体が、組換えタンパク質に対する抗体だとして話を進めると… はい。抗タンパク質の抗体です。 ＞HisTagがN末かC末かどちらに付与されるか不明ですが、 N末であるならば ＞HisTag-シグナルペプチド-成熟型タンパク質 の順番でORFが構築されているなら、 His-TagはN末の６×Hisです。 あと、購入時に塩基配列の提示を要求したのですが 特許の関係で拒否されました。そして、ベクターMAPしかありません・・・ CMV(動物細胞用Promoter）−His-tag−Mc1−ORF ORFとHis-Tagが分かれているのですが、この場合も、シグナルペプチドと一緒に、細胞内で切り離された可能性があるということでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1799-2 - 2008/08/21 (木) 11:07:28 - EcoRI >私はＣＨＯ細胞にHis−Tagつき組み換えタンパク質の遺伝子を導入しました。しかし、生産させたタンパク質は、His-Tagスピンカラムで回収できません。 >免疫染色で確認したところ素通り液にしかタンパク質の発現はみられません。 この免疫染色に用いた抗体が、組換えタンパク質に対する抗体だとして話を進めると… HisTagがN末かC末かどちらに付与されるか不明ですが、 N末であるならば、 コンストラクトのシーケンスを確認をすべきだと思います。 HisTag-シグナルペプチド-成熟型タンパク質 の順番でORFが構築されているなら、シグナルペプチドと一緒に、 細胞内で切り離された可能性があります。

Ｈｉｓ-Ｔａｇ遺伝子の導入後の欠落の可能性 削除/引用 No.1799-1 - 2008/08/21 (木) 10:52:51 - Ｋ はじめまして。 私はＣＨＯ細胞にHis−Tagつき組み換えタンパク質の遺伝子を導入しました。しかし、生産させたタンパク質は、His-Tagスピンカラムで回収できません。 免疫染色で確認したところ素通り液にしかタンパク質の発現はみられません。 pH4.0〜8.0、溶出試薬であるｲﾐﾀﾞｿﾞｰﾙ濃度0〜500mM Ureaでの変性も行い同条件で再検討しました。 Bufferで溶媒置換を行い吸着条件に近づけ、無血清条件で培養しても結果は同じです。 抗His-Tag抗体で免疫染色しても認識されませんでした。 「His-Tag遺伝子のみ導入されなかった。」 ということはありえるのでしょうか? 詳しい情報を下記に記載します。 ・His-Tag付組み換えタンパク質導入ベクターは某メーカーから購入。 ・リポフェクション法。 ・組み換えタンパク質のみ発現。 ・変性条件下でもHis-Tag認識できず。 ボスは「購入したベクターは絶対だ!」と言い張ります。 どうか良いアドバイスをお願いいたします。

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