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(無題) 削除/引用 No.1799-23 - 2008/08/22 (金) 16:17:40 - IRES > ＞導入細胞を取るのに時間がかかるとのことですが〜〜〜導入から精製まで一ヶ月掛からないくらいです。 > IRIEさんは細胞遺伝子導入に慣れていらっしゃるんですね。ｴﾚｸﾄﾛﾎﾟﾚｰｼｮﾝ法で導入されているのでしょうか。 IRIEが私のことをさしているのであれば違います。リポフェクション法です。 それとG418はあまり私は好みません。puromycinやBlasticidinだと2-3日で十分にセレクションが掛かります。 > 某メーカーのほうではN末端HisTagしか販売しておらず、N末端で問題ないと…。メーカーも何度か製品確認を行っているものだと思っていました。 > プロが行うとほぼ１００％で導入でき、学生が行った場合や、その他の何らかの要因でうまく導入されなかったのでしょう。 > 多くの検討の末、購入しましたが、製品の情報を鵜呑みにするのではなく、さらにもっと多くの勉強をしておくべきだったと改めて思いました。 > ありがとうございます。 ベクターが悪いのではありません。ハッキリ言えば研究計画があまりにもずさんなのです。分泌タンパク質をTag付きで精製することを考える場合、シグナルシーケンスの存在を考慮することは私はかなり初歩的な事だと思います。また、どこのメーカーかは知りませんが、His tag用のベクターは色々なメーカーから販売されています。これらを用いることは考えないのですか？ もう少し、いやかなりみなさんの親切なコメントをしっかり検討してくれるといいなぁと思います。

(無題) 削除/引用 No.1799-22 - 2008/08/22 (金) 15:53:13 - おお セレクションですが、その時間は使う薬剤マーカーでもかなり違ってきます。G418は効き始めるのに1週間はかかると思います。ブラスチジン Sは比較的早いと聞いています。どの程度の量必要かによると思いますが、トランジェントでバイチを回収していくというのもありかと思います。それと、シングルのクローンを拾っているのでしょうか?コロニーを選択せずセレクションをかけて、増えるのに半年はちょっと不思議です1ー2ヶ月というところでしょうか。シングルコロニーを拾う必要もないかと思いますが。 >改めて思ったのがメーカーの製品は絶対ではなく、 メーカーが絶対かは置いておいて、目的や使用方法によっては(常識的に)使えないと言う事はでてくるはずです。メーカーに聞くよりも同じ分泌系のたんぱく質をタグをつけて精製している論文とかをよく調査するべきだったかもしれません。メーカーの人はサイエンティストでない場合もありますし、マニュアルで答えている人もいますからきめ細かいところはフォローしてない可能性がありますし。

(無題) 削除/引用 No.1799-21 - 2008/08/22 (金) 15:25:57 - 愚者 話が通じていないみたいですね。 そのベクターに問題があるとは誰も言っていませんよ。貴方の実験にはそのベクターは使えませんよと指摘しているんです。 この実験のデザインをした先生に、一連の回答を見せて相談してみることを強くお勧めします。それでも先生がこれで大丈夫なはずだと固執したとしたら・・・ちょっと別の心配をした方が良いかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.1799-20 - 2008/08/22 (金) 15:20:31 - Ｋ 丁寧な回答ありがとうございます。 ＞導入細胞を取るのに時間がかかるとのことですが〜〜〜導入から精製まで一ヶ月掛からないくらいです。 IRIEさんは細胞遺伝子導入に慣れていらっしゃるんですね。ｴﾚｸﾄﾛﾎﾟﾚｰｼｮﾝ法で導入されているのでしょうか。私は不慣れな上、リポフェクションで導入を行い、G418耐性で選択をしています。ｴﾚｸﾄﾛﾎﾟﾚｰｼｮﾝでの導入効率には遥かに劣り、細胞選択中に全滅もよくあります。なぜかCHO細胞は選択に３Weekは要してしまいました。なかなか細胞が剥がれて死滅せず、濃度を上げたりしました。そういう経験から、多く見て半年と答えました。さらに、精製が目的ではなく、実験のひとつの中間過程でありまして、やり直す時間がないとお答えした次第です。 ＞EPOはシグナルシーケンスを持ってますので、発現タンパクはtagが切断されている可能性が高いと思います。皆さんがおっしゃるように、C末端側にTagが付いているベクターを購入し直すか、C末にＰＣＲでtagを入れた方がいいと思います。 某メーカーのほうではN末端HisTagしか販売しておらず、N末端で問題ないと…。メーカーも何度か製品確認を行っているものだと思っていました。 プロが行うとほぼ１００％で導入でき、学生が行った場合や、その他の何らかの要因でうまく導入されなかったのでしょう。 多くの検討の末、購入しましたが、製品の情報を鵜呑みにするのではなく、さらにもっと多くの勉強をしておくべきだったと改めて思いました。 ありがとうございます。 ＞Westernで検出されたタンパク質が、内在性のそれと同じ分子量であるなら、糖鎖付加が行われているというのは確かで〜〜〜〜糖鎖が付加されたタンパク質を目的としているのであればだめですね。C末にタグを付けるのが妥当だったでしょう。 返答していただいた内容の意図に沿っているかわかりませんが、 不思議なことにEPOの分子量に問題はありませんでした。マーカーやPCでも確認したところ、分子量は妥当です。 EPOの糖鎖が修飾されていなければ、全分子量の１/３が減少してしまっているはずです。しかし、断定はできません。ER内の糖鎖付加など、もう少し文献を漁って調べてみようと思います。 > いまからコンストラクトを作り直して再チャレンジというわけにいかないのなら、アフィニティー精製はあきらめて、ゲル濾過などで精製するしかないのではないでしょうか。 はい、みなさんのアドバイスを聞いていくうちに、His精製は断念し、他の方法で精製を行ったほうが良いと思うようになりました。 これから糖鎖の付加を増加させる方法を検討し、さらに糖鎖の付加状況の解析、例えば二次元やTOF-MSなどを使ってはじめて目的達成です。 改めて思ったのがメーカーの製品は絶対ではなく、手技や条件、細胞等、目的で、成果はかなり左右されてしまうのだと身をもって経験しました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1799-19 - 2008/08/22 (金) 14:56:50 - IRES コメントが二つ付いているようなのでコメントを付け直しますが、 私が細胞内のTagつきのタンパク質をWBで検出してはどうかと提案したのは、シグナルシーケンスがTagとmature proteinの間に入っていることを想定したのではなくて他のなんらかの原因で切断されている場合を想定してのことです。 そもそもTagが付いたものがちゃんと発現しているのかどうか疑問に感じたからです。 折角なのでここまでのコメントを僭越ながらまとめると 1.Tagとmature proteinの間にシグナルシーケンスが入っているかどうか明確でない場合にはコンストラクトのシーケンスを調べる。 1.-1入っている場合にはC末にタグを付け直すか、シグナルシーケンス-Tag-mature proteinに作り直す。 2.コンストラクトを作り直す時間が無ければmature proteinを他の方法で精製する。 となりそうですね。 ただ、手元のに遺伝子の組み込まれたコンストラクトがあるのですから、作り直すのにそんなに時間がかかるものなのでしょうかね？ むしろ精製系を確立する方が時間がかかるように思いますが...精製系組ながらコンストラクトを作り直すのが早いのではないでしょうか。 案ずるより生むが易しのように思います。

(無題) 削除/引用 No.1799-18 - 2008/08/22 (金) 11:45:52 - おお >[Re:17] APさんは書きました : > 教科書的な一般論ですが、 > 、シグナルペプチド自体はER内のある酵素によって切り離されます（たしか、この移行はリボゾームで翻訳されたそばから順次進んでいき、翻訳が完了する前にシグナルペプチドは切り離されてしまうはずなので、切り離し前のタンパク質も検出できるというのは疑問です）。 私もそう思います。シグナルペプチドは切断された後に速やかに分解されると聞いたことがあります。また翻訳直後に切断され、ER内で糖さ付加、ゴルジへの移行とプロセスされていきます。そう簡単に検出できないだろうなと思います。 > > いまからコンストラクトを作り直して再チャレンジというわけにいかないのなら、アフィニティー精製はあきらめて、ゲル濾過などで精製するしかないのではないでしょうか。 > わたしも、この意見に賛成ですね。HISタグを使わないで精製してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1799-17 - 2008/08/22 (金) 11:22:34 - AP 教科書的な一般論ですが、 分泌タンパク質、膜タンパク質、糖鎖タンパク質にはN末に疎水性のアミノ酸20残基くらいからなるシグナルペプチドがあります。シグナルペプチドが、翻訳されたタンパク質のER内への移行を方向づけし、シグナルペプチド自体はER内のある酵素によって切り離されます（たしか、この移行はリボゾームで翻訳されたそばから順次進んでいき、翻訳が完了する前にシグナルペプチドは切り離されてしまうはずなので、切り離し前のタンパク質も検出できるというのは疑問です）。 糖鎖付加はER内で行われます。 Westernで検出されたタンパク質が、内在性のそれと同じ分子量であるなら、糖鎖付加が行われているというのは確かで、ということはERへの移行が通常通りに行われていることになるので、N末が切り離されていておかしくないのではないでしょうか。 遺伝子からシグナルペプチドの部分を取り除いたmature formになるようにコンストラクトを作ればN末は切り離されないはずですけれど、糖鎖が付加されたタンパク質を目的としているのであればだめですね。C末にタグを付けるのが妥当だったでしょう。 また、この件とは直接関係はないですが、 不溶化したタンパク質でも変性可溶化させればアフィニティーカラムで精製できる場合もありますが、必ずそうというわけでもないです。可溶化してもくっつかないことも多いです。 いまからコンストラクトを作り直して再チャレンジというわけにいかないのなら、アフィニティー精製はあきらめて、ゲル濾過などで精製するしかないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1799-16 - 2008/08/22 (金) 11:03:14 - ＤＮＡＩ EPOはシグナルシーケンスを持ってますので、発現タンパクはtagが切断されている可能性が高いと思います。皆さんがおっしゃるように、C末端側にTagが付いているベクターを購入し直すか、C末にＰＣＲでtagを入れた方がいいと思います。シーケンスおよび精製条件検討に時間を費やしても徒労に終わる可能性が高そうです。

(無題) 削除/引用 No.1799-15 - 2008/08/21 (木) 21:25:56 - IRES みなさんが指摘しているのは、分泌タンパク質にはin-mature-formで細胞内で産生され、分泌時にN末端側に存在するシグナルペプチドが切断され、mature formとして分泌されるものがあります。エリスロポエチンにはシグナルシーケンスはあるのですか？あるとしたらHis-signal-mature proteinとなるので、これではHisが切り離されるということです。もし、これにあてはまるのであればC末端側にTagをつけるかsignal-Tag-hEPO(signal除く)を構築する必要があります。 導入細胞を取るのに時間がかかるとのことですが、私は293T細胞に同じように分泌タンパク質のコンストラクト(signal-Tag-mature protein(signalを除いたもの))とpuromycin耐性プラスミドを共導入、puroで1週間程選択。生き残ったものを導入細胞としてpuroで選択圧を掛けながら使っています。精製時には無血清培地に換えて2週間ほど培養、supから精製すると1Lあたり1mgほどのタンパク質を得ています。導入から精製まで一ヶ月掛からないくらいです。

(無題) 削除/引用 No.1799-14 - 2008/08/21 (木) 20:52:59 - Ｋ ＞１．ORFというのはhEPOの開始コドンから終止コドンまでの全長ですか？ そうです。 ＞２．Mc1とは何ですか？ マルチクローニングサイトの略です。制限酵素で切断できる部位です。 記載もれがあったのですが、Mc1とMc2があります。 CMV(動物細胞用Promoter）−His-tag−Mc1−ORF−Mc2 の構造ですが、 -------[CMV]−（backbone　end）−[Mc1（GAA GGA GTT CGA ACC)] ATG- [ORF]-TAG-[Mc2(CTC GAG TGC GGC CGC)]-A（Backbone　Start）−−−−−−− Mc1：XmnI、NspV Mc2：XhoI、NotI のみでしか切断できない設定になってます。 ORFでの制限酵素での切り出しは実行しています。問題はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1799-13 - 2008/08/21 (木) 20:38:54 - 愚者 まだるっこしい書き方をしてしまいました。 ORFが開始コドンから終止コドンまでの全長を指すなら、 「CMV(動物細胞用Promoter）−His-tag−Mc1−ORF」というデザインでは、もしhEPOが分泌されたとしても、His-tagはシグナル配列と共に取り除かれるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1799-12 - 2008/08/21 (木) 20:36:02 - Ｋ {追記} His-Tagスピンカラムの詳細を記載し忘れていました。 プロトコール Native条件 平衡化Buffer：0.5ｍMリン酸Buffer（pH６〜８）NaCl　0.3M Wash：平衡化Buffer＋5mM　ｲﾐﾀﾞｿﾞｰﾙ 溶出：平衡化Buffer+250mM　ｲﾐﾀﾞｿﾞｰﾙ Urea変性条件 平衡化Buffer：１Mリン酸Buffer８M　Urea（ｐH８） Wash：平衡化と同様 溶出：１Mリン酸Buffer８M　Urea（ｐH６） です。 これでは確認できなかったので、トラブルシューティングや文献を参考に リン酸Buffer濃度は固定し、ｐH４〜８まで広げ、 ｲﾐﾀﾞｿﾞｰﾙ濃度（０〜５００ｍM）でｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄをかけたりしました。 変性条件でも同様にしました。 全て素通り液にしかEPOは確認できませんでした・・・。

(無題) 削除/引用 No.1799-11 - 2008/08/21 (木) 20:30:44 - 愚者 ああ、やっぱり尋ねて良かった。 それで、あなたがNo.1799-3でお書きになっている、「CMV(動物細胞用Promoter）−His-tag−Mc1−ORF」という発現プラスミドの構造についても教えてください。 １．ORFというのはhEPOの開始コドンから終止コドンまでの全長ですか？ ２．Mc1とは何ですか？

(無題) 削除/引用 No.1799-10 - 2008/08/21 (木) 20:21:15 - Ｋ いろいろな指摘ありがとうございます。 愚者さんのいうとおり、 まとめて記載したいと思います。 ・生産タンパク質は分泌タンパク質であるヒトエリスロポエチン（hEPO）です。 ・免疫染色とは、SDS-PAGEで電気泳動後、WesternBlottingを行い、抗EPO抗体＆抗His抗体を用いました。 （手順） １．血清下で細胞増殖 ２．無血清条件下で培養（タンパク質生産） ３．培地を限外ろ過膜で濃縮後、スピンカラム吸着条件Bufferで置換（透析のような作業） ※カラムのプロトコール記載条件のUreaで変性。（タンパク質の立体構造での封入体を変性させるため） ４．スピンカラムで精製 ５．WesternBlotting ６．ﾒﾝﾌﾞﾚﾝ１枚目：抗EPO抗体、２枚目：抗His抗体 という手順です。 ｈEPOは３２ｋDaで　分子量の約１/３が糖鎖です。（とても割合が多い） ＞近くに糖修飾部位などがあって十分なアフィニティーが得られないのかもしれません。 これは初めて聞きました。そのような可能性もあるのかもしれません。 ＞売り物のベクターがそんなにおかしいことになることはあまり無い気がします。 わたしもそう思います。しかし、ベクターを購入した際に、経験者の指導の下でろ紙から抽出したのですが、一向に増殖せず、問合せたらグリセロールストックからきたので、すこし胸に引っかかることがあります。 しかしこれは質問内容とは異なりますので無視してくださって結構です。 あと、複数の方のご指摘のとおり、「シークエンスを行ったほうが良い」という考えはあります。謎を解明するためには時間をかけて行うのが最善です。しかし、これが導入されていなかったとなれば、修士終了までにもう一度導入するという時間はなく（動物細胞への導入は半年はかかる：増殖が大腸菌より遅く、クローニングにとても時間がかかる） シークエンスして、導入がされていなかった、または配列が不適だったという結果を得るためにシークエンスを行うのかどうかという個人的な事情がある為、迷っていた次第です。申し訳ありません。 しかし、みなさんの指摘を聞いていくうち、シークエンスを行う方向で考えていきたいと思うようになりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1799-9 - 2008/08/21 (木) 18:59:20 - 愚者 議論をあれこれ進める前に、そもそもそのタンパク質は細胞質のタンパク質なのか、膜タンパク質なのか、分泌されるタンパク質なのかをトピ主さんに明らかにしてもらった方が良いのではないでしょうか。でないと、いくつかの回答は的外れということになりかねませんよ。

(無題) 削除/引用 No.1799-8 - 2008/08/21 (木) 18:48:10 - EcoRI HisTagが切り離されたかどうかを確認するために、 whole cell lysateでwesternするなら、 PAGEはペプチド用のPAGEでなさる方がよろしいかもしれません。 切り離されたHisTag-シグナルペプチドは２０アミノ酸残基程度ですから、 普通のPAGEでは分離は難しいと思います。 BPBラインにスタックされたタンパク質やペプチドの集合体にバンドがでても、 なんのこっちゃわからんと思います。

(無題) 削除/引用 No.1799-7 - 2008/08/21 (木) 18:20:04 - IRES 細胞内で切り離されているにしても切り離されていないものは細胞の中にあると思います。 発現細胞のwhole cell lysateでの抗His抗体を使ったWBでもバンドは出ませんか？ それとシーケンスは確認しておいた方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1799-6 - 2008/08/21 (木) 16:12:50 - A 参考になりませんが私は同じような状況にPichaである蛋白質を 発現させた時に同じような状況に陥りました。私の場合はC末で したがKさん同様に目的蛋白質に対する抗体で発現を確認できるの ですが非変性、変性のどちらの状況でもNi-beadsに結合しませんし、 発現確認は抗His抗体では出来ず最終的にそのプロジェクトを断念 しました。目的蛋白質からHis-tagまでに短いリンカー部分も ありましたから発現後にその辺りで内在性のプロテアーゼによって 切断されたのだろうと想像しています。今回もそれに近い状況かも 知れませんね。

(無題) 削除/引用 No.1799-5 - 2008/08/21 (木) 14:05:56 - おお 分泌するタンパクであれば、すでに指摘があるように、デザインで気をつけなくてはいけませんね。一度設計した結果得られる配列をもう一度冷静に見てみて、シーケンスしてみる必要もあるかもしれません。ブラントのライゲーションとかどう言うわけか間に数ベースかんでいたなんて言う事も場合によってはあり得ます。サブクローニングの時複数の当たりクローンが得られると思いますが、複数のクローンで実験すると、万が一のアクシデントを逃れることが出来るかと思います。、あと、シグナルペプチドいがいにプロセッシングされる可能せいもあるかもしれませんね。近くに糖修飾部位などがあって十分なアフィニティーが得られないのかもしれません。 バイチは透析した方がいいですが(アミノ酸などHisの結合を阻害するものが結構あるので)、ある人が何も考えずにバイチにそのままNiレジンをほりこんで回収できたという人もいます。透析するならトリスよりも燐酸バッファーを私なら使うと思います。 とにかく現状Hisはあなたのターゲットにはついてないか、ワークしない状況です(多分Niカラムについてのプロトコールに落度はないと思いますが詳細について書いていませんので、、、ちなみにNiカラムは酸性領域ではHisとのアフィニティーはありません)。トランスフェクションでHisだけ都合よくというのも確率的に低いと思いますので、その辺をふまえてボスと発展的なディスカッションができるように願っています。

(無題) 削除/引用 No.1799-4 - 2008/08/21 (木) 14:03:24 - クロロ 発現した後に、cellの内外のプロテアーゼ等でhis-tagが切られているだけでは？（分解されているのでは？ということです）CHOはやったことがないのでよく分かりませんが、his-tagは微生物だとけっこう削られるなり、endoの酵素でhis-tagの内側で切られていたりすることがあります。免疫染色とはcellを染めたと言うことですか？それともwesternですか？hisもしくはmycの抗体で見えず、蛋白の抗体で見えるならそういうことではないでしょうか？売り物のベクターがそんなにおかしいことになることはあまり無い気がします。

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