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(無題) 削除/引用 No.1798-16 - 2008/09/10 (水) 00:28:48 - あらし >I was just wondering how you got the material (cDNA). Was it from a inbreeding strain. チャールズリバーから来ました。 特殊なものではなく、一般的に流通してる実験用のチキンだと思います。 >そういえば、チキンならBACライブラリーがありますよね。 目的の配列を含むBACを入手して、そこから切り出すのもいいかと思います。 BACライブラリーというのを、今まで使ったことないので教えてください。 自分のほしい遺伝子がどのライブラリーに含まれているかは、 BAC numberというので確認するのでしょうか？ BAC numberの調べて方が分からないので、教えてもらえませんか？

(無題) 削除/引用 No.1798-15 - 2008/09/09 (火) 08:08:14 - おお >[Re:14] あらしさんは書きました : > >あと、チキンの場合は個体のバリエーションはどこまで考慮が必要なのかなとおもいました。 > > 少し気になったので教えてください。 > チキンは個体によって同じ遺伝しても遺伝子の配列が違ってくるのでしょうか？ I was just wondering how you got the material (cDNA). Was it from a inbreeding strain. Or more crude genetic background... Even if it was form a inbreeding strain, was it same strain as the data base you referred? In the case of mice, I am familiar with such information, but I do not know much about chicken. In human genome sequence it is said that the occurrence ratio of individual variation is 1 per 1000 bps.

(無題) 削除/引用 No.1798-14 - 2008/09/09 (火) 07:09:15 - あらし >あと、チキンの場合は個体のバリエーションはどこまで考慮が必要なのかなとおもいました。 少し気になったので教えてください。 チキンは個体によって同じ遺伝しても遺伝子の配列が違ってくるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1798-13 - 2008/08/26 (火) 11:11:39 - あらし >>おおさん コメントありがとうございます。50度くらいで試してみます。 今まであまり深く考えてませんでしたが、最初のcycleで伸長反応がうまくいけば、 その後のcycleもうまく行くと考えたらいいんですね。

(無題) 削除/引用 No.1798-12 - 2008/08/23 (土) 12:13:09 - おお >[Re:11] あらしさんは書きました : > > アニーリングは57でも結構低いと思ってましたが、50くらいまで下げることも可能なんですか？ > 20マーぐらいがターゲットにアニールすることをかんがえると、50くらいまで下げてみてもいいと思います。場合によっては、最初の数サイクルを低いアニーリング温度でやって、そのあとから引き上げるというのもありかとおもいます。１度プライマーから伸びたプロダクトができれば、33merの全部がアニールするわけですから。

(無題) 削除/引用 No.1798-11 - 2008/08/23 (土) 06:43:46 - あらし みなさんアドバイスありがとうございます。 >25ベースぐらいは取った方がいいと思います(個人的には27-30ぐらいをゲノムでは使います) 長いプライマー作ってみます。 >ノンスペだらけになる手前の条件が見つかればいいかとも思っていますので。 アニーリングは57でも結構低いと思ってましたが、50くらいまで下げることも可能なんですか？ >perfect matchのprimerでまずふやしてみて増えればそれをtemplateにして制限酵素付きのprimerで増やし直すというわけにはいかないのですか？ なるほど。試してみる価値はありますね。 >私の経験でも、1M betain+0.5%DMSO添加でGC-richなIkB遺伝子のexonをゲノムDNAから増幅したことがあります。 ベタインのついては、全く知りませんでした。 もう少し勉強してみます。

(無題) 削除/引用 No.1798-10 - 2008/08/22 (金) 19:05:07 - ats PubMedで、”PCR GC betaine DMSO”のkeywordで調べると参考になりそうな論文が出てきます。 最近でも結構論文がでているのですね〜。 私の経験でも、1M betain+0.5%DMSO添加でGC-richなIkB遺伝子のexonをゲノムDNAから増幅したことがあります。primerは長め（30merほど）denatureは98℃と高めにすると良い結果が得られました。 10年くらい昔は、deaza-dGTPを1/3ほど（0.66mM)添加してGCrichな鋳型から増幅させました。 deaza-dG:Cの水素結合は2本なので、G:CペアよりGCrichな領域の解離が容易になるのが原理です。 大腸菌に導入するとdGに戻りますので、deaza-dGTPによる遺伝子変異は考慮不要です。

(無題) 削除/引用 No.1798-9 - 2008/08/22 (金) 13:15:48 - 通りすがり 制限酵素サイトをつけない、perfect matchのprimerでまずふやしてみて 増えればそれをtemplateにして制限酵素付きのprimerで増やし直すというわけにはいかないのですか？

(無題) 削除/引用 No.1798-8 - 2008/08/22 (金) 12:13:08 - おお >[Re:7] あらしさんは書きました : > プライマーの長さは21ベースで端っこに制限酵素サイトを12ベースつけているので、 > 33ベースですが、制限酵素をつけると増幅効率が落ちるとかいうようなことはないのですか？ わたしはあえて、テンプレートにアニールする部分を長くしなさいと申し上げておきます。25ベースぐらいは取った方がいいと思います(個人的には27-30ぐらいをゲノムでは使います)。制限酵素認識部位の影響は一概にいえませんが、少ないことがおおいと思えます。 あとプライマーダイマーが出たとしてももっとアニーリング温度を下げて見るのも手だと思いますが、、、ノンスペだらけになる手前の条件が見つかればいいかとも思っていますので。

(無題) 削除/引用 No.1798-7 - 2008/08/22 (金) 07:10:52 - あらし みなさん、コメントありがとうございます。 バッファーは四種類くらい試して、cDNAも試してみましたがだめでした。 アニーリングの温度も57まで下げましたが、目的のバンドはなくて、 100bpより小さい場所にプライマーダイマーと思われるバンドが出てきました。 プライマーの長さは21ベースで端っこに制限酵素サイトを12ベースつけているので、 33ベースですが、制限酵素をつけると増幅効率が落ちるとかいうようなことはないのですか？ もう少し頑張ってだめなら、BACライブラリーとGCリッチの外側というのも検討してます。

(無題) 削除/引用 No.1798-6 - 2008/08/21 (木) 14:22:06 - ~ そういえば、チキンならBACライブラリーがありますよね。 目的の配列を含むBACを入手して、そこから切り出すのもいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1798-5 - 2008/08/21 (木) 13:02:13 - おお あと、チキンの場合は個体のバリエーションはどこまで考慮が必要なのかなとおもいました。

(無題) 削除/引用 No.1798-4 - 2008/08/21 (木) 12:59:24 - おお わたしはあまり気にしないほうです。単調な配列になるのは気にかけた方がいいとは思います。また数百ベースが80％程度のGCリッチという事なのでその領域にプライマーと似た配列がないかどうかが気になります。そういう意味ではカナマイシン様の意見は参考になりますね。わたしは、決まったところを増やさないといけなく、プライマーに自由度がない場合が多いのですが、たいていの場合酵素や添加物で対処しています。ですから、片方がGC40%もう一方が70%なんて言うのはなんかいかあったと思います(ほんとに気にしてないので詳しくは分かりませんが)。 具体的にはプルフリーディング活性のある酵素を何種類か用意して、どれかでかからないかみてみる。添加するものとして、5%DMSO(10%ぐらいまで上げれる)、ベタイン0.5M、フォルムアミド5%ぐらいまでなどです。市販のエンハンサーでもいいかもしれません(多分ほぼ同じものを使っていると思いますが、、、)。 もし今のプライマーではどうもかからないというのであれば、プライマーをもう一度デザインし直すかもしれませんが、今のプライマーの外側にプライマーを作ればネストで増やせると言う事も念頭に入れておくといいかと思います。 ゲノムに限らずPCRのテンプレートを入れ過ぎる人が結構います。あまり欲張らない方がいいです。ヒトやマウスのゲノムで10から多くて100ng/リアクションで十分です。実際にPCRプロダクトを電気えいどうしたとき、ゲノムDNAがみえるほどつかっている人に減らすようアドバイスをして、うまく行ったということが何度かあります。 あとPCRの方法としてタッチダウンがいいという人がいますね。私はあまり使いませんけど。 シングルエクソンと言う事なので多分イントロンレスか一つのエクソンにORFが収まったものをPCRしようと思っているのだと思いますが、その遺伝子をクローニングしたいと言うことならばmRNAからRTPCRという手もあるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1798-3 - 2008/08/21 (木) 10:19:31 - カナマイシン 対象としている生物の関係上、私の設計プライマーはほとんどがGC%75です。 個人的に考えているコツは… ・5' 側は犠牲にしても、3' 側の端っこに近い部分についてなるべく 　GC-ATの偏りが単調でなくなるようにする（アニールの特異性は5'より3'で効く）。 　例えば同じ75%GCの20 merでも 　　CCGGTCCCGCGCGCTTCATC 　　　は 　　GATGAAGCGCGCGGACCGG 　よりも良い。 ・Final 0.5 M 程度のベタイン入れる（いろんな所でしつこく言ってますが）。 ・酵素はα型酵素よりもTaq型の方がバシっと増える印象がある。 という感じでしょうか。 でも、GCリッチなのはその領域だけなのですよね？ それでしたら私なら一手間加えて ・~様のおっしゃる通り先にGCリッチの外側から増やしてその増幅断片を鋳型にする。 ・適切な制限酵素でゲノムを完全切断してラダー化し、自分の欲しい断片が 　含まれるであろうサイズの位置のバンドを広めに切り出し、溶出。 　これをテンプレートにする。 あたりを試すと思います。

(無題) 削除/引用 No.1798-2 - 2008/08/21 (木) 07:55:40 - ~ GCリッチなプライマーであっても、増えるときは増えますけどね。 どのくらいの検討を行ったうえで、そのプライマーで何も増幅されなかったと結論したのですか？ ポリメラーゼやバッファーを変えるだけで増えるかもしれませんが、何種類くらい試しましたか？ 少しプライマーをずらすことで増えるようになる場合もありますが、プライマーの組み合わせは何種類試しましたか？ アニーリング温度を下げていけば、非特異の増幅は出てくると思いますが、何も増幅しない結果しかないのであれば、アニーリング温度の検討が不足していませんか？ 非特異も含めて少し増幅してから、内側のプライマーで特異的に増幅できませんか？ 数百bp増えるだけなら、GCリッチの外側から増やすというのも1つの手でしょう。

GCリッチなprimer 削除/引用 No.1798-1 - 2008/08/21 (木) 06:44:51 - あらし あるchickenの遺伝子（single exon)の全長(900base程度)をgenomのDNAからPCRで増やすことを試みているのですが、ストップコドンの手前の数百ベースが80％程度のGCリッチとなっているため、GC含量40〜60％のプライマーが設計できず、GC含量75％のプライマーを使って 試したところ、何も増幅されませんでした。 GCリッチな領域をPCRで増幅するには、どうしたらのいいのでしょうか？ いい方法があれば教えてください。

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