全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1797-7 - 2008/08/22 (金) 12:01:32 - おお 私はプレランはしていませんがきれいに流れています。１ベースずつ見る分解能はありませんが(十分ながしていないのかもしれませんが)1mmのコームで数ベースの違いがあれば分解能の十分なところでは移動度にさが出ます。ちょっと前に違うラボからきたポスドクがいつも1.5mmの厚さのゲル(コーム)で流しているといって、それでやってましたが、同じ量流しても1mよりウェルにたまるサンプルの高さが短いせいかバンドもシャープになっています。ゲルはごく普通のアクリルアミド(30:1)で作っています。ゲル板を固定する仕方やスペーサーとコームの厚さの微妙な違いとかも関係するのかなあとちょっと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.1797-6 - 2008/08/22 (金) 09:02:57 - AP >アクリルアミド、TBE buffer も作り直しましたが同じ症状が出ます。 APS溶液やTEMEDは新しくしてみましたか？ アクリルアミド溶液は、シークエンスゲルの場合特に、古くなると分解能が下がったりして問題になります。新しく作り直しても同じということですが、solidのアクリルアミドの品質、保存状態は問題ないでしょうか。 溶液をpH試験紙で測ってみてひどく酸性になっていないかが簡単な目安になります。 >縦にスジ状になっており、解析できないことも悩みです スジが入る原因として考えられるのは、ゲルに不溶性の不純物（使用した試薬由来）やごみが入っていて、移動中のRNAが引っかかっていることが考えられます。APS、TEMEDを加える前にフィルターを通していますか？　吸引フィルターを使って、脱気をかねて脱粒子をするといいです。 ほかには、サンプル中に高分子量のDNAやタンパク質が多量に混じっているせいでRNAの移動が妨げられてスジが入る可能性が考えられます。 >Long Rangerではないので比較は出来ないかもしれませんが、 >プレランが短すぎると泳動が汚いという話を聞いた覚えがあり >３０分にしています。 プレランの目的はゲルを温めて変性温度に近づけることと、アクリルアミドなどに副産物として含まれている、電荷をもって泳動に干渉し分離能を下げる小分子を流してきれいにするためです。後者の目的では10分もやれば十分です。ゲルを温める行為は、ゲルの温度調節機能がある泳動装置なら必要ないですし、そうでなくても、泳動をはじめて早い時期に十分な温度に達するので、それほど必要ないと思います。 いずれにせよ、現にウェルの変形が起こって実験に支障をきたしているので、 「プレランが短すぎると泳動が汚い」かもしれないという心配は二の次では。

(無題) 削除/引用 No.1797-5 - 2008/08/22 (金) 02:57:55 - J 返信が遅くなり申し訳ありませんでした。 ゲルは自作です。 プレランのときはコームは外しております。 シャークコームではなく普通のコームです。 Long Rangerではないので比較は出来ないかもしれませんが、 プレランが短すぎると泳動が汚いという話を聞いた覚えがあり ３０分にしています。 プレラン前とアプライ前にはウェルを洗っているので 未重合というのは考えにくいのではないかと考えています。 ラボの方針としてLong Rangerを購入するのは難しいので なんとかしたいのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.1797-4 - 2008/08/22 (金) 00:06:36 - AP アクリルアミドは自作ですか、それともLong Rangerなど調製品でしょうか。 Long Rangerは泳動しているうちにウェルが盛り上がって変形してしまう傾向が強いですね。 自作のアクリルアミドでもそういう傾向はありますが、かつてはプライマーから遠い配列と近い配列を同じゲルで読むために、同じサンプルを1時間くらい泳動開始に時間差をつけてアプライするということもやっていたのですが、Long Rangerでは、ウェルが変形してしまって無理です。 プレランが長すぎるのではないでしょうか。Long Rangerではプレラン10分が推奨されています。

(無題) 削除/引用 No.1797-3 - 2008/08/21 (木) 13:49:33 - 与平 pre-run中はコームをゲル端まで差し込まないで浮かせておいたらどうですか？

(無題) 削除/引用 No.1797-2 - 2008/08/21 (木) 13:17:55 - おお ゲルの厚さはどれくらいでしょうか? もしかしたら、未重合のアクリルアミドがウェルに残っていてコームを取ったあとに重合したのかもしれません。あと多分ご存じと思いますが、ウレアはアプライの時ウェルから洗い出さないとうまくのらないことがおおいです。 どれくらいの解像度が必要でしょうか?

シーケンスゲル(urea) 削除/引用 No.1797-1 - 2008/08/21 (木) 03:13:00 - J お聞きしたいことがあります。 現在RNAをurea変成ゲルで泳動し解析しています。 しかし、pre-run(30-60 min）後、コームを差し込んでいた部位が 盛り上がってきてしまい、サンプルをアプライできません。 アクリルアミド、TBE buffer も作り直しましたが同じ症状が出ます。 また、これとは原因が別かもしれませんが、 泳動後現像するとバンドがシャープになっておらず、 縦にスジ状になっており、解析できないことも悩みです。 ゲルは６％アクリルアミド8M Ureaで、bufferは1xTBEを使っております。 いわゆるシーケンスゲルと同じ大きなゲル版を使用しております。    どなたか同じようなトラブルを解決したことがある方 がいらっしゃいましたら よろしくお願いいたします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---