BioTechnicalフォーラム [Amiconで濃縮の際にタンパク質が通り抜けてしまう]

Amiconで濃縮の際にタンパク質が通り抜けてしまう

No.1791-TOPIC - 2008/08/20 (水) 09:52:19 - EcoRI

いつもお世話になっております。

18 kDa の組換えタンパク質を精製しています。
バッファー交換の前処理として、
Amicon の MWCO 5000 のフィルターでタンパク質溶液の濃縮をかけていますが、
どうにも、フィルターの素通りの方に、
無視できない量のタンパク質が出て来てしまいます。

SDS-PAGE で確認しています。
(濃縮前のサンプルと比べて、少し細いバンドを与えるぐらい)

濃縮自体は行えているので、深刻な問題ではありませんが、
効率が悪いです。

Amiconの他に、うまい濃縮の方法をご存知の方はいらっしゃらないでしょうか？
　

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No.1791-14 - 2008/09/05 (金) 16:08:59 - EcoRI

ずいぶんと時間が空いてしまいましたが、
A様のご指摘に従って、
遠心スピードを x5000g から x3000g に落として、濃縮しました。
その結果、依然として、素通りに出るものの、
その量は許容できるもの(CBBでかすかに見えるぐらい)になりました。

今回は本当にありがとうございました。
これで済みとさせて頂きます。

(無題)

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No.1791-13 - 2008/08/20 (水) 17:16:46 - EcoRI

ありがとうございます

>これに関してはサンプルを枯らすことがなければどちらでも
>問題ないはずです。
了解致しました。

とにかく、低速度で濃縮を行ってみます。
ありがとうございました。

(無題)

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No.1791-12 - 2008/08/20 (水) 16:59:49 - A

> それから、気になっていることとしては、
> アングル固定のバケットで濃縮している点です。
> スウィング式バケットの方がいいのでしょうか？

これに関してはサンプルを枯らすことがなければどちらでも
問題ないはずです。アングル固定の場合、予想される正確な
ｇの計算がちょっとめんどくさいかもしれません。どのタイプの
Amiconを使われているのかわかりませんがタイプによっては
スウィング式のほうが濃縮効率が良いはずですが、アングル
のほうが枯れる心配が少なかったはずで一長一短だと思います。

(無題)

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No.1791-11 - 2008/08/20 (水) 16:00:42 - EcoRI

ありがとうございます。

>私は念のためいつも最大スピードの70%を目安に
>して濃縮しています。

正直に申しまして、完全に見落としていました。
いつもはカタログスペックを疑っていたのですが、
今回はなぜか最大スピード(x5000g)でやっていました。

検討してみます。

それから、気になっていることとしては、
アングル固定のバケットで濃縮している点です。
スウィング式バケットの方がいいのでしょうか？

(無題)

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No.1791-10 - 2008/08/20 (水) 15:48:19 - A

かなり確認されているようなのでないと思いますが
遠心時のスピードが速すぎる事はありませんか？
当然仕様の限界を超えると膜を素通りしますから。
私は念のためいつも最大スピードの70%を目安に
して濃縮しています。

(無題)

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No.1791-9 - 2008/08/20 (水) 15:31:32 - EcoRI

ありがとうございます。
ミリポア曰く、最高の収率を得るには、1/3程度のMWCOを
とあったので、5000 でいけるかとも思ったのですが…

やはり、MWCO を下げる方法になりますか…
ボスに相談してみます

引き続き、ご回答をお待ちしております。

(無題)

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No.1791-8 - 2008/08/20 (水) 15:01:26 - よっしー

18Kなら微妙ですね．
3000の限外ろ過膜だと落ちないかもしれませんね．
透析膜も極力小さい目の物を使わないとだめそうですね．