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(無題) 削除/引用 No.179-5 - 2007/09/14 (金) 15:39:46 - ~ 私が使っていたHeLa-S3株ではペニシリンキャップ法でできていました。 ただ、HeLaは亜株がたくさんあるので、薄播きに弱く、限界希釈に耐えられない株がある可能性があるので、 予備実験でできるかどうかを確認しておいたほうがいいと思います。 たとえば、私が使っていたHL60は、薄播きに弱く、限界希釈をして、 顕微鏡で細胞が入っているのを確認していて、 その後薬剤を入れていなくても増えてきませんでした。 また、細胞密度が低いときには、 セレクション用の薬剤の濃度を減らさないと増えてこない場合があります。 ペニシリンキャップ法であれば、 複数のシャーレに薄播きでたくさんのシャーレに撒くでしょうから、 (HeLaでは10^4~5cells / 10cm dish位にしていました) その際に、薬剤の濃度を振っておいてもいいかもしれません。 (生えてきた中で、一番薬剤の濃度の高いdishから回収する)

ありがとうございます。 削除/引用 No.179-4 - 2007/09/14 (金) 15:10:34 - ほうれん草 コメントありがとうございます。 とても参考になりました！ あれからいろいろ調べてみると、昔の参考書ですが、クローニングについて書かれていましたのでそちらを参考にして、実験を進めていています。 参考書でが、限界希釈法ではなく、ペニシリンキャップ法でしたので、 当方もペニシリンキャップ法で試してみたいと思います。 HeLa細胞とHuh 7細胞とHEK293細胞で、stable cell lineを樹立したいと思っています。 ウイルスみならいさん、NO.179-2さんに共通しているのが、HeLa細胞ではクローニングができないとの事でした。 今ちょうどG418でセレクションをかけ始めたところなので、うまくいきましたら報告します。 なんでHeLa細胞はだめなのでしょう？？ とても不思議です！

体験談 削除/引用 No.179-3 - 2007/09/13 (木) 16:29:10 - ウイルスみならい 私もつい先日、COS7とHela細胞を用いて、クローニングに初挑戦しました。 作業の流れは、プラスミドをワンカットして、細胞に導入後、限界希釈法で96穴プレートに0.5個/wellになるようにまきました。あとはしばらく培養していると、うまくいけばコロニーを形成するので単一のコロニーのみのwellの細胞をふやしていきました。 私もやってみて感じたのですが、セレクションがかかっているはずなのですが、ウエスタンで蛋白質の発現を確認してみると、かなりのクローンで蛋白質が発現していませんでした。 あと、同じラボの細胞を専門にしている人に聞いたのですが、Hela細胞の場合、なぜかクローニングを試みてもうまくいかないそうです。実際、自分もHela細胞は失敗しCOS7細胞のみクローンが取れました。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.179-2 - 2007/09/12 (水) 19:41:29 - ~ HeLaのサブクローンによってはできないかもしれないので、 一度親株で生えるかどうか試してみてはいかがでしょうか。 イラストレイテッド第6巻「すくすく育て細胞培養」は培養初心者には役に立つと思います。

stable cellの作成方法について 特にクローニング操作！！ 削除/引用 No.179-1 - 2007/09/11 (火) 20:27:59 - ほうれん草 はじめてトピックを作成させていただきます。 今実験で、ある蛋白質を恒常的に発現させた細胞を作成しています。 vectorを形質転換後、G418で細胞をセレクションしました！ そのご、ブロットで発現量を確認しましたが、あまり発現していません。 いろいろ原因を調べてみると、どうもクローニングをする必要があるとわかりました。 クローニングには、限界希釈法やペニシリンキャップ法で、クローニングできることがわかりましたが、当方の在籍している研究室では、クローニング操作をやった人がいない為に、詳しいことがわかりません。 現在考えている方法として、HeLa細胞と使用して限界希釈法で希釈し、96well plateでシングルセルからクローニングしようと考えています。 なにぶん、初めてですので、この方法であっているのか不安ですので、あっているか教えてください。この方法で気をつける点などがありましたら、教えてください！ またクローニングについてわかりやすく載っている参考書等がありましたら、教えていただければうれしいです。 よろしくお願いします！

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