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(無題) 削除/引用 No.1777-8 - 2008/08/22 (金) 00:23:19 - コロ そうですね、今度泳動するとき注意して見てみます。 どうもありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.1777-7 - 2008/08/20 (水) 17:01:09 - おお >[Re:6] コロさんは書きました : > 普段は、インタクトなものが濃くて、少し丸まった感じのバンドとして、ベクターの実際のサイズより小さいところに現れるくらいしか見ていませんので、おおさんのおっしゃるバンド形状の違いというのはどういうことなんでしょうか？ うまく言い表せないのですが、一度制限酵素できってないのと、切って直さになったものを同時に流してみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1777-6 - 2008/08/20 (水) 15:03:06 - コロ みなさん どうもありがりとうございます。 先生には聞きましたが、理由は分からんけどよくあることの返事だったので、こちらで聞いてみようと思いました。 実際のところ、ライゲーションがうまくいっていないことが判明しました。これからちゃんとコントロールを入れるようにします。 普段は、インタクトなものが濃くて、少し丸まった感じのバンドとして、ベクターの実際のサイズより小さいところに現れるくらいしか見ていませんので、おおさんのおっしゃるバンド形状の違いというのはどういうことなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1777-5 - 2008/08/18 (月) 20:31:13 - AP おそらく、そういう変なクローンは普段からかなり混じっているのだと思いますよ。おおさんのおっしゃるとおり、系がうまく動いていなくて、目的のクローンがあまり出てこない時に目立つだけで。 デザインした実験系がうまくいくようにすることが、最良の解決だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1777-4 - 2008/08/18 (月) 19:43:50 - 白髪鬼 おおさんの仰ることに尽きるのですが、上手く行っていないときには良くあるパターンです。こんなところで聞くより、まずは信頼できる先輩か指導教員に聞いてください！ お願いします！

(無題) 削除/引用 No.1777-3 - 2008/08/18 (月) 15:56:06 - おお まず環状で、ニックの入っていないプラスミド(つまりインタクトなプラスミド)はたいていの場合その直さにおけるサイズより幾らか小さいところにえいどうされます。ライゲーションされていないベクターが直さのまま大腸菌にはいり、それを適当に大腸菌が末端をつなぎ合わせてプラスミドを作っちゃうことがありますが、そういう場合両端は適当に削られてしまっていることが結構あると思います。ですからマルチクローニングサイトがつぶれて、酵素で切れないため、酵素処理しても切れずオリジナルのサイズより小さいところにエイどうされてしまうことはあります。とくにライゲーションがうまくいってなかったりすると、ピックアップしたものがそういった削れたものを拾う頻度が上がりますので、目立ってくると思います。またインタクトのプラスミドはバンドの形状が直さのものとちょっと違うのでそういう意識で見ると違いが分かるようになってきます。 ただし、実際にそういうものを質問者が見ているかは断言できないところはありますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1777-2 - 2008/08/18 (月) 15:38:40 - M&S 抽出したDNAは制限酵素処理をしましたか？ 環状のまま泳動しているのであれば高次構造によって移動度がかなり変化するので単純なサイズの比較は難しいと思います。

プラスミド抽出後の大きさ 削除/引用 No.1777-1 - 2008/08/18 (月) 13:59:24 - コロ 目的DNA断片をpGEM easy vectorに入れて、形質転換して、白いコロニーを形成する大腸菌からプラスミドを抽出しました。しかし、泳動してみたところ、空ベクターよりもサイズの小さいところにバンドが出ました。今までこのようなことを経験したことがなく、これはどういう訳かどなたかお教えください！ お願います！

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