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(無題) 削除/引用 No.1774-2 - 2008/08/16 (土) 19:14:18 - よゐこ ラベルしたプローブの希釈列を作って、ナイロンメンブレンに1 uLずつスポットして、励起光（たとえばUVトランスイルミネータで）を当ててみてどのくらいまで見えるかでラベルがうまくいっているかをチェックしてみてはどうでしょうか。理想的にラベルされたコントロールがあるともっといいですが、なくても1 pg以下のスポットまで見えなければ、中期染色体にたいするFISHでは難しいと考えていいでしょう。 Nick translationは鋳型の長さや配列などによって反応時間などの至適条件がかなり異なりますので、決まったプロトコールどおりでいつもうまく行くとは限りません。

FISH用probe作製について 削除/引用 No.1774-1 - 2008/08/16 (土) 18:20:26 - めばえ 最近FISHを始めました。 プロトコルは同研究室の先生が以前行っていたというものを借りてやっています。 私が同じプロトコルでFISHを行うと、ハイブリしません。 現在行っているFISHは、Nick Translation Kit(Roche社)とFluorescein-12-dUTP(Roche社)を用いてprobeを作製しています。 Nick Translationで標識後、ニシン精子DNAとyeast tRNAを標識probeに加え、エタ沈してハイブリバッファーに溶解しています。 このエタ沈の時に、FITC標識できたprobeは黄色いペレットができるようなのですが、私の場合、真っ白なペレットしか得られません。 そもそも、黄色いペレットが本当に得られるのかどうかも不明ですが、標識がちゃんとできていないような気がして、日々probe作製の所で戸惑っています。 probe用のDNAは約400bpsでPCR産物をゲル抽出(QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN社製)により精製したものを使用しています。 AT含有量は70％です。 反応系は DNA400ng分、dNTP mix(0.5mM dATP,dCTP,dGTP, 0.05mM dTTPに調整したもの)3.2ul、10×buffer 2ul、dUTP(FITC, 1mMのもの) 0.8ul、Enzyme 2ulに滅菌水を加え、total 20ulの系になるように調整し、15℃2hr反応させました。 その後反応を止めるために65℃ 10min反応させ、0.5M EDTA(ph8.0)を1ul加えています。 この後、ニシン精子DNA(10mg/ml)とyeast tRNA(10mg/ml)を2ulずつ加え、エタ沈しています。 もしかしたら、標識はできていてハイブリの条件が悪いのかも、とも思ったりもしますが、 標識ができているのかいないのか不鮮明なままでは先に進めず、 今に至っています。 もしよかったらアドバイスをください。 お願いします。

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