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(無題) 削除/引用 No.1770-6 - 2008/08/31 (日) 12:09:06 - おお aji様 ありがとうございます。今回は具体的な実験にそった質問でなく、ちょっと知識的な面で確認したかっただけなんです。でも丁寧な説明ありがとう御座いました

(無題) 削除/引用 No.1770-5 - 2008/08/31 (日) 01:07:46 - aji おおさん > de novoシーケンスというのをよく聞きますが、MS/MSで配列を予想してデーターベースなどを利用してタンパクを同定するのとでは、MS/MSで生データーを得るというプロセスまでで何か違いがあるのでしょうか。 プロセスというのが実験のことでしたら基本的に同じなのですが、やはり目的、装置の性能によって違いが出てきます。どのような手順の予定なのか分かりませんが、目的ペプチドがHPLCのピークとして同定されていて、きれいに分離していて、メジャーなm/zがはっきりしている、という状況なら、それに対するMS/MSからde novoシークエンスは簡単に出来、修飾などもMS/MSデータから解釈可能な場合が殆どです。 LCを通さずフィンガープリンティングとしていくつかの断片のm/zが一致しており、それのMS/MSならそもそも親イオンの純度が低かったりするのでMS/MSのチャートそのものがかなり複雑ですが、既に配列の候補が決まっているので、それに一致する断片の大部分が見えるなら同定出来たといえるでしょう。 逆に複雑なMS/MSチャートから配列を同定するには親イオンの分子量からアミノ酸組成を限定させ、その中に一致する組み合わせをピックアップさせるところまでが理論的に可能ですが、MSの精度により、組み合わせの多さが違ってきます。また、この場合は修飾の解析はどのぐらい出来るのでしょうか？最新のソフトの性能を知らないので、実際の成功率は分かりません。 MSの精度が高いほど、いろんな問題が簡単になるのは確かですが、本当はLCの分離能が一番重要です。MSが自前ならいいのですが、共同研究者がそこまで検討してくれる人かどうかによって、得られるデータは全く違います。

(無題) 削除/引用 No.1770-4 - 2008/08/30 (土) 05:57:10 - おお 皆さんありがとうございました。大体様子が分かってきました。 追加質問です。どなたか分かる方がいれば幸いです。 de novoシーケンスというのをよく聞きますが、MS/MSで配列を予想してデーターベースなどを利用してタンパクを同定するのとでは、MS/MSで生データーを得るというプロセスまでで何か違いがあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1770-3 - 2008/08/16 (土) 11:54:08 - MS屋 おおさん ajiさんの書き込みに同意です。 選ぶ酵素、ゲル内消化の条件などによって同じ蛋白質でもcoverageは簡単に変わってきます。蛇足ですが完全に精製された蛋白質にはお目にかかったことがないです。（そういって渡してくださる方は多いのですが） 「確からしさ」に関しては、使用するソフトウェア（アルゴリズム）とデータベースによって変わってきます。ペプチドと書いておられますが、MS/MS によるペプチドシークエンスとすると、ソフトウェアごとに異なるFalse positive, False negativeが存在します。Ａというソフトウェアでは同定にいたったものがＢでは至らないという結果もままあり、より精度を求めるのであれば2つの異なるソフトウェアを用いて同定を行うべし、という論文も見られます。 　また、用いるMSの精度によってはトリメチル化とアセチル化を同一化してしまう場合があり、翻訳後修飾を受けている蛋白質の場合は同定は難しいです。（ソフトウェア上で指定はできるのですが、私の経験では同定の確かさはぐっとさがります） 　ajiさんも書かれていますが、「自分の目で」データを読むことは非常に大切です。結果を鵜呑みにしないことが一番重要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1770-2 - 2008/08/15 (金) 20:51:57 - aji coveragedは本当にタンパク質によって違います。ほぼ完全に精製したタンパク質からでもプロテアーゼ処理後の断片が得られなかった経験もあります。ただ一般的には20-70％ぐらいの範囲に入る場合が多いと思います。 確からしさの判定にデータベース的に由来生物のすべてのタンパクと照らし合わせることが可能なソフトもありますが、これをやると時間もかかります。解析ソフトによっては確からしさを評価するパラメーターで表現されることが多いですが、それを鵜呑みにして良いわけではありません。 MS/MSでde novoシークエンスすればほぼ確定したといって良いと思います。ペプチド断片だけならcoverageよりは断片数が多いほどいいですよね。 時々ある失敗例としては、理論値との誤差だけを基準に判定すると、Na付加体やK付加体がたまたま別の断片と同じm/zになることはあるので、自分でスペクトルを見ることは重要です。

MSでタンパクを同定 削除/引用 No.1770-1 - 2008/08/15 (金) 15:59:05 - おお MSでタンパクを同定する時、例えばあるたんぱく質をCBBでシングルのバンドになるように精製して、LC-MS-MSを行った時coverageで何%ぐらい得られるものなのでしょうか。もちろんタンパクによりますので答えはないと思いますが、プラクティカルに100%はないとか、経験で何%から何%までの範囲で得られているとか、、 あと、そのタンパクである確からしさを判定するのに、ここのペプチドのデーター(確からしさ)をどのように反映しているのでしょうか?

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