全26件 ( 21 〜 26 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.1768-6 - 2008/08/15 (金) 21:19:12 - kamadoneko いやいや、素晴らしいですよ、是非うちに来ていただきたいくらいです。 テクニシャンがプロトコールを変えてはいけないわけがありません。 研究者がプロトコールを作るときにすべてに厳密な条件検討を行っているわけではなく（もちろんいじってはいけない点はあるにしても） 理論に裏打ちされてることは、こういう細かな操作になると、この世界ではあまりないので 正しいシグナルが再現性を持って得られていれば良いんです。 決して理不尽な条件ではありません。時間がかかりすぎるというご不満はもっともですが、確かに、そういうものもあります。 ブロッキングのあとのTW20washはおそらく、BSAでブロックできなかった疎水性の部分を塞いでいるんだろうと思います。 BSA、PY20ともに長時間が必要なのは、親和性が低いからでしょう。 BSAの場合は非特異的な部位との。 低温の方が良いのは、蛋白の構造の揺らぎが少なくなるせいかもしれません。 プロトコールは、皆で作っていくものです。 もっと御自身で改良して、ボスに自慢されたらいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.1768-5 - 2008/08/15 (金) 20:03:59 - いい天気♪ さっそくのアドバイスありがとうございます。 ですが、PY20の扱いはとても難しいです。 私はこれまでJNK, ERK, p38, FAK, paxillin, Akt, Lyn など数多くのリン酸化抗体の使用経験はありますし、リン酸化抗体ではない例えばEGFR, PDGFR-a, c-Cbl, actin, HSP70…等数えきれない程多くのwesternを行ってきました。 なので自分の腕には自信がありますし、キレイなスパンッとしたbandを出すのが私のポリシーだと感じています。 ただPY20だけは経験者でなければ分からないコツがあると思います。 通常のprotocolで行えばbandはとても汚くでます。 blockingを室温, 1時間（37℃で行ったことはありません）で行うとやはり失敗します。 blockingを４℃, 12時間でも失敗します。 ですが、blockingを４℃、24時間行ったあと、激しくwashした後、1st Abを4℃、24時間でキレイなbandがでます。 blockingを24時間もやって、その後PBS+0.05 % Tween20で激しくwashなんかしてたらblockingする意味ないやん！！って言われますが、これを怠ると汚いbandになります。。。 テクニシャンですが、この条件検討は私が行ったものなので、参考になるアドバイスがあればどんどん改良していきたいと思っております。 本当にPY20は厄介な抗体です。。 どうか引き続きご教示ください。

(無題) 削除/引用 No.1768-4 - 2008/08/15 (金) 17:40:48 - ＧＥ 変更点はBlockingを室温１時間ぐらいでしょうか？これで１日は短縮できると思います。 あとは普通だと思います。 時間節約も大切ですが、綺麗なデータが信憑性につながるので、急がば回れということも大切だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1768-3 - 2008/08/15 (金) 16:59:31 - りょう 向上心は買いますが・・・テクニシャンが勝手にプロトコール変更しても良いのでしょうか。 第一に、指導者と相談されるのがベストでしょう。 真摯にお答えするならば、以下の点が気になります(変更可能点）。 blockingは必要最低限行えば良い(バックグラウンドが出なければ良い）ので24hは短縮できるでしょう。37度など温度を上げてblockingするのも時間短縮には良いでしょう。 PY20は使用したことないですが各種リン酸化抗体を使用していますが5%BSAで室温１時間でも問題ないです。最近ではCELL BIOLABS社のphosphoBLOCKER Cat No. AKR-103を使用しておりprotocolでは５％で使用するように記載されていますが2.5%(室温最低30min）でもバックでないしシグナルもBSAより強いです。一次抗体は全てO/N(8h−16h)です。 ECL plusは確かに普通のECLより感度が10-20倍高いですが、気をつけないと（washをしっかりしないと）バックが強いですね。milkよりBSAの方がバック強いでしょうからそれと合い重なってリン酸化蛋白の検出に苦労されているのでしょう。 僕はECLで最初にバンド出して、充分なシグナルが出なかったらリンス後、ECLplusで再トライします。 参考まで。

(無題) 削除/引用 No.1768-2 - 2008/08/15 (金) 16:18:03 - α そんなに急ぐ必要があるのでしょうか？ 何かの作業工程の途中で、PY20検出のステップがあり、検出確認済みの試料を用いてさらに別な実験、、、と続くなら別ですが。 ある程度条件検討済みで、かつ、きれいにしっかりバンドが出るなら、条件を変えない方が無難かと思います。振とう装置など実験器具の追加配備で他の実験に影響が出ないようにすれば、合間に他の仕事もできますし。

チロシンリン酸化抗体PY20の扱い方について 削除/引用 No.1768-1 - 2008/08/15 (金) 15:41:46 - いい天気♪ 名古屋の研究室にて研究を手伝わさせていただいているものです。 テクニシャンです。 PY20を使って刺激に応じたタンパクのリン酸化を見ています。 もういくつかのlabを渡り歩いてきましたが、PY20ほど難しい抗体はないなと感じている今日この頃です。 現在のprotocolでは時間がかかりすぎるというのが一番の問題（改良したい点）です。 通常のwestern blottingでは、 操作�@blocking：1-5 %スキムミルクin PBSで長くて１時間, 室温（しないときもありますが） 操作�A1st Ab：blocking bufferで希釈して0.2-1ug/mlの濃度で抗体反応、室温、一時間 操作�B2nd Ab-HRP：blocking bufferで希釈して抗体反応、室温、0.5時間 操作�CECL plusにて検出 PY20を用いたwestern blotingでは、 操作�@blocking：5% BSAin PBSで24時間、４℃ 操作�A1st Ab：5% BSAin PBSでHRP-PY20を希釈して抗体反応、24時間、４℃ 操作�BECL plusにて検出 時間かかりすぎですよね。 ですが条件検討の結果これが一番キレイにうまくしっかりbandがでるんです。 みなさんはPY20をどのように使っておられますか？ ぜひ教えて下さい！！

全26件 ( 21 〜 26 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---