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(無題) 削除/引用 No.1768-26 - 2008/08/21 (木) 18:53:32 - 地の塩 何となく決着してしまったような印象なのですが、違和感があるので繰り返させてください。 ここでの問題は、ブロッキングが不十分でバックグラウンドが上がるということではないんですよね。バンドのないところにはシグナルが出ないんですから。 ということは、「バンドがボケる」という、バンドの周囲のそのボケた部分というのは、当然そこに抗原が微量ながら存在するから現れている訳です。にもかかわらず、ブロッキングの操作によってその部分が消えてバンドがシャープになっているというのは、本来抗原の量に従って十分な階調をもって表現されるべきバンドを、人為的に閾値を導入することによって強引に階調を落とし、見かけ上きれいなバンドを作り出しているということではないのですか？それって、目指すべき方向なんですか？ 以前に、それまで使っていたHRP標識２次抗体の代わりにHRP標識プロテインA/Gを使ったら、正規分布のような輪郭を持っていたバンドがまるでペンで書いたようなバンドになってしまって、気持ちが悪いなと感じたことがあります。その時のことが思い出されました。

(無題) 削除/引用 No.1768-25 - 2008/08/19 (火) 17:33:29 - PY20 GEヘルスケア（昔のアマシャムファルマシア）の総合カタログ2008-2009がてもとにあれば7-25ページをいちど見て下さい。PY20のWBでは洗浄バッファーの塩の組成や濃度が結果をかなり左右することを示唆するデータが出ています。

(無題) 削除/引用 No.1768-24 - 2008/08/19 (火) 16:42:32 - GE 保守派のα さんの（１）が不十分な場合、バックグラウンドの上昇が考えられますが、いい天気♪さんのお答え（No.1768-16）では、バックグラウンドはブロッキングの時間に関係なく”常に低い”といっています。 今回は、バックの問題では無く、バンドの問題であるので、もし長時間のブロッキングが抗原をマスクするのであれば、短時間のブロッキングの方がバンドがマスクされずしっかりと出ると思います。 突拍子もないことかもしれませんが、ＢＳＡに含まれる何かしらの不純物またはブロッキング再利用中にもち込んだ不純物が長時間のブロッキング中に何らかの形で目的バンドに結合し、それがPY20と反応することで、輪郭をすっきりさせているということは考えられないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1768-23 - 2008/08/19 (火) 15:22:58 - 地の塩 ブロッキングが不十分だとバックグラウンドが上がるというのは分かるのですが、バンドの輪郭がぼやけるというのはどういうことなのでしょうか？それって、本来なら弱いシグナルがあるところに人為的に閾値を設けているということではないですか？

(無題) 削除/引用 No.1768-22 - 2008/08/19 (火) 15:11:40 - 保守派のα いい天気♪ さんの手法ですが （１）長時間のブロッキングで完全にPVDF膜を覆う。この時点では抗原もマスクしてしまう。 （２）PVDFと直に接しているBSAをはがさない程度の洗浄液（PBS/Tween20）で抗原の表面を覆うBSAをwash outし、抗体とアクセス可能にする。 ことで高いＳ／Ｎ比の免疫ブロッティングを実現しているのだと思います。 したがって、提案されているブロッキング時間の短縮は（１）を不完全にしてしまう可能性があります。室温１時間のブロッキングは標準的ですが、やはり長時間（一晩〜長時間特有の問題が出るまで）のブロッキングには劣るというのが、私が経験的に（PY20ではありませんが）知り得たことで、決めの図を作りたいときには、必ず室温で２〜３時間＋４度で一晩以上ブロッキングするようにしています。 いい天気♪ さんの目指すＳ／Ｎにもよりますが、一般的な論文掲載レベルの免疫ブロッティング、すなわち、多くの論文やメーカーのデータシートに掲載されている免疫ブロッティングの写真を見て、ちょっと汚いなとか自分だったらもっときれいなデータを出せると思うようだったら、手を抜かない方が良いですよ。 と深読みしました。

(無題) 削除/引用 No.1768-21 - 2008/08/17 (日) 23:44:28 - GE いい天気♪ さんのお答えからすると、”ノンスペシフィックな反応を抑えるため”のブロッキングは１時間で十分だと思います。 今回注目する点は、一晩のブロッキングが１時間のブロッキングよりも抗原・抗体反応を上昇させているということではないでしょうか？ そう考えると、りょうさんのおっしゃるように抗原・抗体反応を阻害するような操作は除いて、上昇させるようにすれば時間短縮になると思います。 ＞＞一応これまでに、時間短縮と同時にS/N比を上げる他の方法として２次抗体の増幅効果、BSAの代替としてphospho-blockerなど案を出しています。 いいアイデアだと私も思います。 他にも単純にサンプルの量や抗体量を増やせばうまくいくかもしれません。この辺は、貴重なサンプルであったり、研究コストが限られた状態では変更できませんが・・・。

(無題) 削除/引用 No.1768-20 - 2008/08/17 (日) 18:10:44 - りょう >[Re:19] あららさんは書きました : > > 一時間では上手くbandは出なかったと記載されていますよ。 > それとポンソウ染色を「まあ、不必要ですね」とは何を基準にそういったことが言えるのでしょうか。確認することが不必要なんですか、ため息が出ますね。 その部分も読んでます。一応「あららさん」に返答しておきます。 GEさんが質問されたように１時間ではバックが強く出てS/N比が悪く、綺麗なバンドが見えなかったのならBlocking効果(バックを消すための24時間処理）が一因だと思えるのですが、１時間でもバックは出ないとなると、24時間Blockの処理がもたらした効果は他にあるはずです。そこで邪魔をしているか知りませんが「抗原抗体反応に悪影響を及ぼす可能性が否定できないポンソー」が24時間置くことで比較的邪魔しない状態になったのではと考えたのです。 PY20のシグナルを綺麗に出す目的としては「ポンソーは不必要です」。 このトピの目的に即してコメントさせていただいたつもりです。 ポンソーやるにしても抗体シグナル出してから後染めしてほしいです。 データとしてもリン酸化状態の変動を見ておられる訳ですから、controlとしてそのリン酸化蛋白のtotal量をセットで出されるでしょうし。 一応これまでに、時間短縮と同時にS/N比を上げる他の方法として２次抗体の増幅効果、BSAの代替としてphospho-blockerなど案を出しています。 初めの方で誰かが「短縮できるのはBlockingくらいでしょう」とコメントされたことに私は同意していて１次抗体O/Nは避けられないと考えています。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.1768-19 - 2008/08/17 (日) 13:59:43 - あらら こちらも横から失礼します。 一時間では上手くbandは出なかったと記載されていますよ。 それとポンソウ染色を「まあ、不必要ですね」とは何を基準にそういったことが言えるのでしょうか。確認することが不必要なんですか、ため息が出ますね。

(無題) 削除/引用 No.1768-18 - 2008/08/17 (日) 02:24:33 - りょう 文章に誤りがありました。 >[Re:17] りょうさんは書きました : > 横から失礼。 > > １．一連のやり取りを拝見してですが、1時間のみのBlockingでもbackは出ないということから考えると1時間だったと見受けられます。 > 　 正：1時間のみのBlockingでもbackは出ないということから考えるとBlockingの操作としては1時間で充分だったと見受けられます。

(無題) 削除/引用 No.1768-17 - 2008/08/17 (日) 02:21:56 - りょう 横から失礼。 １．一連のやり取りを拝見してですが、1時間のみのBlockingでもbackは出ないということから考えると1時間だったと見受けられます。 ２．その際のバンドの出方が弱くなるのは他が原因では？例えばポンソー染色が邪魔をしているとか。Loading・transferが一様かを見られているのでしょうが、まあ不必要ですね。 ３．バックが出ないようでしたら抗体濃度を挙げるとかした方がスパッと出るのでは？ ４．一次抗体にHRP標識されたものを使用されているということは増幅効果が望めません。なので非標識PY20を１次抗体として用い、2次抗体でanti-mouse-polyclonalAb-HRPを使用して1エピトープに対するHRP数を複数にすればS/N比は上がるかも。2次抗体がdirectに拾うノイズは幾つかあるかもしれませんが、control実験でどれか判断できるので問題ないですね。 参考まで

(無題) 削除/引用 No.1768-16 - 2008/08/17 (日) 00:23:24 - いい天気♪ GEさん >汚いと言うのが、”バンド”であって”バックグラウンド”でないような印象を受けたので、再確認のためお聞きします。 はい、そうです。backはキレイでlong exposeしてもbackは上がってきません。 バンドがぼや〜っと出現します。輪郭は不明瞭です。 >”ブロッキング１時間で抗体一晩”と”ブロッキング一晩で抗体一晩”で、まったく同じ時間exposeさせた場合、前者の方はマイナーバンドがはっきりしないと受け取っていいのでしょうか？ はいその通りです。 >その際のバックグラウンドはどうなっていますか？ backはでません。 >つまりお聞きしたいのは、前者の方ははっきりしたバンドが出る前にバックが高くなってしまう、後者の方はバックがほとんど無いので長時間exposeさせることができ、その結果としてシャープなバンドが見えると言うことは無いでしょうか？ そういう訳ではないです。 kamadonekoさん なるほど、そういった考えが出来る人は本当に尊敬します。 ありがとうございました！！！ 一度、テクニシャンなりにみなさんからの意見を取り入れて効率の良いPY20の扱い方を調べてみようと思います！！ありがとうございました！！！

(無題) 削除/引用 No.1768-15 - 2008/08/16 (土) 16:54:33 - kamadoneko 私の書いてるのは完全に経験的なもので、それにあとから理屈つけてるだけなので、ご了解ください。 TW20の効果はwashというよりはブロッキング効果と思えます。 実は、私もBSA/PBSだけでのブロッキングでやっていたことがあり、そのあとに0.05％TW20/PBSでincubateした方がバックが下がることに気がついたことがありました。 下に書いたのは、そのときに考えた理屈です。 TW20はBSAに比べてずっと小さいので、BSAが立体障害で結合できない隙間にも入り込んで、 バックの原因となる疎水性の表面に結合しているんだろう、ということです。 バックがなぜ出るかというと、大抵はHRP複合体が抗原以外の場所に結合するからで、 多くの場合、それは疎水性結合によると思われます。 静電結合なら高塩で洗えば落ちるはずですので。 他にもいろんな種類の結合があるのでそう簡単に言って良いのかどうかわからないのですが、 TW20が効くと云うことはTW20の疎水性の部分でその表面に結合して、TW20の親水性の部分が外に向いて、親水性の面に変えるんだろうと思いました。 IRESさんも言われているように、TW20入りのBSA溶液でやればいいかもしれません。 ただ、TW20自体がBSA表面の疎水性部分（たぶん、これがBSAのブロッキング効果の主体かな）を塞ぐかもしれないので、そうなると、BSAのブロッキング効果を弱めるかもしれません。 疎水性結合だけで考えると、ならばTW20だけでやればいいだろうということになりますが、 BSAは確かに効果ありますよね。 これは、BSA表面は複雑なので、TW20にない他のいろんな相互作用によるブロッキング効果を持ちえるから、と逃げましょうか。 ともかくいろんな条件を試されてみてくださいというしかないです。 うまくやれば37度でずっと短い時間で同じくらいのバックになる条件が見つかるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1768-14 - 2008/08/16 (土) 16:29:19 - GE いい天気♪ さん 詳細な情報ありがとうございます。参考になります。 汚いと言うのが、”バンド”であって”バックグラウンド”でないような印象を受けたので、再確認のためお聞きします。 ”ブロッキング１時間で抗体一晩”と”ブロッキング一晩で抗体一晩”で、まったく同じ時間exposeさせた場合、前者の方はマイナーバンドがはっきりしないと受け取っていいのでしょうか？ その際のバックグラウンドはどうなっていますか？ つまりお聞きしたいのは、前者の方ははっきりしたバンドが出る前にバックが高くなってしまう、後者の方はバックがほとんど無いので長時間exposeさせることができ、その結果としてシャープなバンドが見えると言うことは無いでしょうか？ お聞きしたようにバックグラウンドが高いのが問題になるのであれば、ブロッキングを短時間でより効率よくする方向に変更すればいいと思います。一方、バックグランドはまったく変わらないけれどバンドのシャープさのみ異なるのであれば抗体の反応をいじればいいと思います。 ブロッキングの問題であれば、BSA以外の市販のものでいいの無いですかねー。どなたか知りませんか？

(無題) 削除/引用 No.1768-13 - 2008/08/16 (土) 11:57:25 - IRES そうするとblocking液の組成があまりよくないようですね。 kamadonekoさんのご指摘のようにTween20でのwashの段階でblockingも兼ねているのであれば5%BSA blockingのときにTween20を加えてはいかがですか？ というより私はいつもどの抗体のときもblocking液は5%BSA in PBSではなくて5%BSA in 0.1%Tween20-TBS or 5%BSA in 0.1%Tween20-PBS 室温1hr-o/nでやっています。 いい天気さんのプロトコールとの相違はこの点ですね。kamadonekoさんのご指摘で今気づきました。

(無題) 削除/引用 No.1768-12 - 2008/08/16 (土) 11:53:05 - いい天気♪ 連続投稿すみません kamadonekoさん できればTween 20の働きについて分かっていることが有れば教えて頂けないでしょうか？ なぜwashing bufferにTweenを入れるのか。 blocking剤として働くのですか？

(無題) 削除/引用 No.1768-11 - 2008/08/16 (土) 11:50:37 - いい天気♪ 私のやり方 細胞：burkitt lymphoma Ramos cells 刺激：anti-BCR antibodyを用いた人工的な抗原刺激 時間：0, 5, 15, 30, 60 min あっ、詳細な実験を書いていますが、PY20のポジコンとしてやってる実験なので実際B細胞の研究をしている訳ではないです。一応念のため。 lysis buffer：cell signalingの10 x cel lysis bufferの組成を参考にした手作り品。 detergentは1 % TritonX100です。 SDS-PAGE：10-20 ug/laneで8% SDS-PAGE transfer：semidry方式。200mAの定電流で75 min。 　　　　　transfer buffer：Current protocol of molecular biologyを参考に（20 % メタノール） blocking：transfer後、DWで軽くwashしてポンソー染色。さっとDWですすいで5% BSA in PBS（Tween 20なし） ブロッキングで4℃、24時間shake。一次抗体にHRPが直接付いたPY20を用いるのでアジ化Naなしです。blocking終了後は、そのため-40℃保存です。何度も（15回はいけます）使い回ししています。 wash：0.05 % Tween 20 in PBSで５回ほど15 min間隔でのwash（謎でした） HRP-1 st Ab：BD transduction社のHRP-PY20 x1000希釈 in 5 % BSA in PBS （Tween 20なし）。４℃、24時間。PVDF膜の上に抗体を乗せてパラフィルムをかぶせます。 wash：0.05 % Tween 20 in PBSでwash, 5 min間隔で4回くらい。 ECL：ECLを2 min反応後、expose to form, 5-30 min。 以上です！！再現性はいいです。bandもシャープです。 今、思いましたが、blocking bufferにTween 20入れてないですね。 で、blockig後、Tween 20入りのwashing bufferで洗ってるので、もしかしたら始めからblocking bufferにTween 20を0.05 %入れておけば、もう少し時間の短縮になるかもしれませんね。あー私なんで今までこれを疑わなかったんだろう。。やはり研究者には向きませんね（笑） もう少し、自分なりに条件検討してみて、またその結果アップしますね。

(無題) 削除/引用 No.1768-10 - 2008/08/16 (土) 11:32:16 - いい天気♪ kamadonekoさん >ブロッキングのあとのTW20washはおそらく、BSAでブロックできなかった疎水性の部分を塞いでいるんだろうと なるほど、TW20にもそのような働きがあるんですね。ありがとうございます。 IRESさん 汚いバンドというのはボヤけているbandという意味で使いました。 blocking 1hr, r.tで、かつ1st Ab, 1hr, r.tでも「major」な太いリン酸化bandははっきりでます。 しかしminorなリン酸化の変動はbackがぼやけてるので、判別つきません。 しかし、私が検討した条件ではmajorなbandはしっかり出て、しかもminorなbandもシャープにキレイな輪郭で出ます。ムラもないです。 やはり、４℃の抗体反応がいいんだろうと思ってます。 が、、、ブロッキングがかかりすぎですよね。 何度も12時間、４℃でやったり１時間、室温でやったりしましたが…再現性よくシャープなbandは得られませんでした。長時間プロトコルでは再現性よく安心して実験出来ます。やはりこの条件は変えない方がいいかもしれませんね少なくとも私のやり方では。ありがとうございます。 GEさん 分かりました。 では詳細なprotocolをアップしますね。（正直恥ずかしいですが） もし、PY20をお使いの方がおられましたら改善点など教えて下さいね。

(無題) 削除/引用 No.1768-9 - 2008/08/16 (土) 09:27:56 - IRES ここまで熱心に実験していただけるテックの方がいらっしゃるラボはうらやましいです。うちの大学院生につめの垢でも煎じて飲ませたいぐらいです(笑) 私も含めて大学院生や研究を生業とされる方は労働時間はさほど気にしない傾向がありますが技官の方にとっては重要なファクターだと思います。 勿論、手を抜くという意味ではなくて、限られた時間の中で出来るだけ多くの結果を出したいという意味でです。これは研究者にとっても追求するべきことで、そういった観点から時間短縮プロトコールを作ることは重要なことだと思います。 PY20のバンドが汚く出るというのはどのような状況なのでしょうか？ 汚いといっても複数バンドが出る(今回は特定のタンパク質に対するものではないのでたくさんバンドが出ると思いますが...)、バックが高くて真っ黒になる、反対にバンドがまったくでない、あるいは黒い斑点がたくさん出るなど様々だと思います。それぞれはそれぞれの理由があるので一概にこう対処すればよいというのは難しいと思います。 例えば時間短縮を目的とされているので"通常の"とされているプロトコールで行われた場合はどのような状況なのでしょうか？ 個人的には"時間かかりすぎ"プロトコールは抗体反応はしょうがないとしてブロッキングの時間がうっとうしく感じますね(笑)

(無題) 削除/引用 No.1768-8 - 2008/08/15 (金) 21:42:19 - ＧＥ それと個人的な要求で申し訳ないのですが、今後のPY20の実験のためにさらに詳細な情報を載せていただけしょうか？ 先程書かれていたPBS+0.05 % Tween20で激しく洗うといった情報は一番最初の投稿になかったと思います。 詳細な情報は私を含め読んでいる人にも有用だと思います。また、詳細な情報を読んだ有識者がきめ細かいアドバイスをくれるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1768-7 - 2008/08/15 (金) 21:26:50 - ＧＥ たくさんのＷＢをやられているようで経験豊富だと思います。 確かにPY20や他にもセリン、スレオニンリン酸化抗体といったリン酸化特異的抗体には癖があるかもしれません。 ただ、いい天気♪ さんはPY20が難しい抗体ということで、何度も試行錯誤し、現在の最高の条件を見つけられたのではないでしょうか？それで最高に綺麗なバンドが出るのであれば申し分ないと思いますが。。。 それよりも、α さんがおっしゃるように空いた時間を他の仕事に回すほうが効率がいいと思います。 ＞＞JNK, ERK, p38, FAK, paxillin, Akt, Lyn など数多くのリン酸化抗体 これらリン酸化抗体といっても普通の抗体とあまり変わりません。

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