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(無題) 削除/引用 No.1756-15 - 2008/08/15 (金) 14:19:22 - あや おっしゃるとおりです。 実験計画をねりなおしてみたいと思います。 ご指導ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1756-14 - 2008/08/15 (金) 14:04:54 - りょう 上手く行ってない時はあらゆる過程での対照実験（同条件での）が必要だと思います。 対照実験を密度の異なる細胞で行ったり、lipidのみの添加で行ったりと条件が異なると意味がないと思います。 PBS wash後に無血清・低血清状態にするだけで死なないのか？ 他の細胞では上手くtransfectできる腕なのか？plasmidの質は問題ないのか？など、これまでに幾つか挙げさせていただいた疑問点に対する答えは一つも得られているようには思えません。

(無題) 削除/引用 No.1756-13 - 2008/08/15 (金) 09:56:11 - あや ありがとうございます。 一応mediumのみで培養しているものは順調に増えております。 ちなみに、ほぼコンフレント状態の細胞にlipidをかけたて8時間くらいおいてみたのですが、それでは細胞は死んでおりませんでした。 細胞密度が低いのが原因でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1756-12 - 2008/08/15 (金) 00:50:37 - りょう 他の細胞ではtransfection問題ないですか？ DNA-lipidなしで一連のmedium changeだけでは問題ないですか？ 普通に行って、transfectionの過程でそれほど死ぬとは思えないのですが。 DNAに変なコンタミとか無いですよね。 気になる部分はその辺りです。

それでも 削除/引用 No.1756-11 - 2008/08/14 (木) 23:46:08 - あや 改善すべきとこは改善したのですが、やっぱり細胞全滅です。 今回はtransfection後4時間の時点でmedium changeしたのですが・・・ transfection時の細胞をもうすこし増やしたほうがいいのかしら？と思います。５０％弱でtransfectionしてしまっていはいました。

(無題) 削除/引用 No.1756-10 - 2008/08/12 (火) 17:24:34 - あや りょうさん＞ ありがとうございます。 ワンチューブでtryしてみること、25分静置におくこと、transfection6時間後にmedium changeすることをtryしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1756-9 - 2008/08/12 (火) 17:05:23 - りょう >[Re:8] あやさんは書きました : > > 使用している細胞は子宮内膜間質細胞です。 その細胞は扱ったことないですね。 でも繊維芽細胞メインですかね。だとしたら普通に導入できて死にもしないと思います。 > 一応おっしゃるようにしています。ただ、今回は、transfection後培地を交換するまでが、実はよく考えると8時間になってしまいました。それが問題ですかね〜 それは結構きついかもしれません。 6hで充分DNA-lipidのcomplexが細胞表面やdish上に付着するのが観察できるので、それ以上長くするのはあまり意味がないでしょう。毒性も経時的に増加するでしょうし。 > > 導入日（３６時間後） > �@PBS　1mlで2回wash washは必要ないかも。僕は交換のみです。primary neuronだったらこの操作だけでも、さっさと行わないとダメージはいります。 一般の細胞やfibroblast-likeなら問題ないでしょう。 > �AOPTI-MEM1を1.5ml/well加える > �B試薬調整 > Ａ：250 ulのOPTI-MEM1とshRNA 2.5 ugを混合する。ここに、PlusReagentを　　2.5 ul加える。 > Ｂ：250 ulのOPTI-MEM1とLipofectamine LTX 6.25 ulを穏やかに混合し、室　　温に5分間静置。 > ＡとＢの2種類の溶液を一つにあわせて穏やかに混同し、さらに室温に20分間静置。 インビトロジェンではLTXの場合、ワンチューブプロトコールを推奨していますよね。僕はワンチューブでしかやったことないので比較できませんが。 （初代lipofectamineや2000はtwo-tubeです） 脂質添加後はプロトコールでは25-30minです。 僕の感触でも25-30がDNA-lipidの粒粒のでき方が良い。 lipofectamine2000では20minくらいでしたかね。 > �Cこれを、準備していた6 well plateの細胞の上にまく。穏やかにplateを回　転させ、培地が均一になるように混合する。 > �Dインキュベーターへ入れ48時間培養する。 工程４−５の間に当然medium changeが入っていますよね。 このとき、PBSなんかで１−２回rinseしてから交換すると毒性は低くなるのでは。 全体的に拝見して、8時間放置した所以外は特に問題なさそうです。 子宮内膜間質細胞を扱ったことないので直接的なコメントは僕には無理です。 他の人の意見も参考にしてください。 他の一般的な細胞で同様の方法で導入してみて、状態を見ると導入方法の問題か？細胞の弱さなのか？が検討できるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1756-8 - 2008/08/12 (火) 16:13:16 - あや りょうさん＞ ありがとうございます。 使用している細胞は子宮内膜間質細胞です。 便宜上、shRNAが手に入りやすい状況でしたので、使用しています ＞確認ですが、DNA-lipidを作用させる時は無血清（あるいはOPTI-MEMのような低血清）・無抗生物質状態にして下さい。 一応おっしゃるようにしています。ただ、今回は、transfection後培地を交換するまでが、実はよく考えると8時間になってしまいました。それが問題ですかね〜 一応以下のようなプロトコールに沿っておこないました。 導入前日 6wellplateに、2×105/wellの細胞をまく。(導入当日に50〜80%conflent) 導入日（３６時間後） �@PBS　1mlで2回wash �AOPTI-MEM1を1.5ml/well加える �B試薬調整 Ａ：250 ulのOPTI-MEM1とshRNA 2.5 ugを混合する。ここに、PlusReagentを　　2.5 ul加える。 Ｂ：250 ulのOPTI-MEM1とLipofectamine LTX 6.25 ulを穏やかに混合し、室　　温に5分間静置。 ＡとＢの2種類の溶液を一つにあわせて穏やかに混同し、さらに室温に20分間静置。 �Cこれを、準備していた6 well plateの細胞の上にまく。穏やかにplateを回　転させ、培地が均一になるように混合する。 �Dインキュベーターへ入れ48時間培養する。 いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1756-6 - 2008/08/12 (火) 15:44:12 - りょう 細胞種を示していただければ具体案が示唆できるかもしれません。 お聞きする範囲での予想ですが、DNA-lipid complexによる毒性でしょう。 4-6時間は妥当な時間なのであまりいじりようがありません。 細胞種が不明なので何とも言えませんが、6well-sizeにLTXを最高９マイクロリットル作用させたことがありますが、それほど死細胞が出るようには思えません。かなり複数種の細胞を扱った経験上です。 手技的な項目が若干気になります。 確認ですが、DNA-lipidを作用させる時は無血清（あるいはOPTI-MEMのような低血清）・無抗生物質状態にして下さい。 大抵の試薬説明書には血清存在下でも導入可能とかmedium chang必要無しと歌っていますが、毒性・効率上、やはり除いておいて交換した方が良いです。あと、plasmidの質にもよりますね。最近のトピでもありましたがエンドトキシンの影響とか。 話がそれますが、数キロベースのshRNA vectorをわざわざ導入するのは、効率・配列（効く配列かどうか）などの問題でどうなのかなあと思います。 人それぞれの好みですし、薬剤耐性で安定発現細胞を得る必要がないなら、siRNAオリゴの方が断然効率良いと思っています。 配列の当り外れが無いと言って良いほど、好成績です。 20ターゲットくらい設計して全て蛋白レベルでknockdownされてます。 おそらくknockdownされないと場合は導入効率に依存している場合だと思っています。 現実的には導入しにくいprimary cellならウイルスベクターでしょうが、MEFくらいなら余裕でLTXでも70-80%くらい抑制できます。 乱文で失礼

(無題) 削除/引用 No.1756-5 - 2008/08/12 (火) 15:10:59 - あや りょうさん＞ ありがとうございます。書き忘れましたがPlus reagentも使用いたしました。 ＞lipofectionに限らずtransfectは毒性が強いので無処理に比較して浮きやすい・死に安いです。control vectorを同様に処理した物を用意しましょう。 →一応このcontrolも用意しました。まったくの無処理では順調に細胞がふえていますが、transfection試薬とベクターが入っているものが、細胞が死んでしまっております。ですので、原因としては、試薬濃度が濃いからなのでは？とおもっているのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.1756-4 - 2008/08/12 (火) 14:44:00 - ~ >ここでいう血清培地というのは、２％血清培地なのかそれとも、１０％血清培地のほうがいいのでしょうか？ 血清培地というのは、増殖培地という意味で書かれているのだと思います。 増殖させたくないのでしたら、血清飢餓状態にすることは可能だと思います。 ただ、無血清でlipofectamine入りの培地で数時間処理していますので、少なからずダメージを受けていると思います。 いきなり2%にすると細胞が死んだりするかもしれませんので、条件検討が必要でしょう。 >１０％ですと細胞が分裂・増殖しますので何か影響があるのでは？ 入れた細胞を増殖させたくないのでしょうか。 逆に増殖を止めるほうが影響があるように感じますが。 >少なからず細胞は死んでしまうものなのでしょうか？ 多少はダメージを受けますので、死ぬ場合はあります。 濃度や処理時間を減らすことで、改善する場合があります。 (ただ、濃度は薄めのようですし、時間もそれほど長くありませんね) 私の経験だとリン酸カルシウム法の方がリポフェクションよりもダメージが大きい印象です。 使用が可能であれば、shRNA発現ウイルスベクターの方が細胞へのダメージは少ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1756-3 - 2008/08/12 (火) 14:38:54 - おお りょう さまと同じ意見で、交換するのなら普段培養しているバイチに戻すのが普通かと思います。低血清での細胞のふるまいを見たいとかであれば、もちろん血清濃度は下げるでしょうけど。 １度あなたの実験の内容と、増殖との関係について考えてみてもいいかもしれません。ただし、たいていの実験は条件が書いてないような場合は増殖用バイチで培養している状態で細胞を回収していると思って良いでしょう。 最近はトランスフェクション試薬を除かないで良いというプロトコールもありますし、低血清でつかえる工夫されているバイチ(OPTI_MEM、ADVANCED DMEM とか)もありますので、そういうバイチ中(低血清)でトランスフェクションしてそのまま培養といったこともよくあるようです。効率や毒性、shRNAのききぐあいに合わせて実験方法を調整していくといいかと思います。特にRNAiが効果を発揮するには時間がかかるので、その間処理しっぱなしと言うのはある意味理にかなっています。特によく増える細胞では、トランスフェクション後けいだいしてもう一度処理というのもsiRNAでは見かけるプロトコールです。

(無題) 削除/引用 No.1756-2 - 2008/08/12 (火) 12:08:46 - りょう 普通はそれぞれの細胞の維持・増殖に適したmedium（たいてい10%血清)に交換します。分裂してもtransfectには悪影響は無いと思います。 むしろコンフルエントだとtransfection効率が悪く(殆ど入らないかも）なるので分裂できる環境の方が良いかもしれません。 その後の実験次第ですが、無血清での検討を行う場合も、私の場合は取りあえず血清有で一晩培養後、無血清状態にします。 話はそれますが、何のprimaryか知りませんがplasmid量に対するLTXの量が少ない気がします。LTXなら毒性低いので6well-sizeなら8-9マイクロリットルまで大丈夫でしょう。効率悪ければ、6wellあたりに添加できるLTX量も限られるでしょうから、plasmid量を1.5-2.0マイクロリットルに下げる方向にふっても良いでしょう。Plus reagentの使用も良いです。 HEK293やCOSなど入りやすい細胞なら問題なく入るでしょうが。 lipofectionに限らずtransfectは毒性が強いので無処理に比較して浮きやすい・死に安いです。control vectorを同様に処理した物を用意しましょう。 LTXは他のlipofectionと比較して毒性が低いですが、細胞によっては(primary neuronなど）毒性が強くてその後の実験に不都合が出てどうしようもない場合がありますので、少し気にかけておいて下さい。 そんな場合はcalcium phosphate法なんかは比較的マイルドかも。

shRNAベクター導入後の血清培地 削除/引用 No.1756-1 - 2008/08/12 (火) 10:14:56 - あや いつも勉強させていただいております。 RNAi実験を始めたところなのです。実験方法としては、ヒトprimay culture細胞を培養し、6welldishにまき、細胞が５０％コンフレントになったところで、shRNAベクター2.5ugとリポフェクタミンLTX6.25ulを加えtransfectionしました。 プロトコールでは、transfection後４〜６時間後から、抗生剤・血清含有の培地に変えてよいと書いてあります。 ここでいう血清培地というのは、２％血清培地なのかそれとも、１０％血清培地のほうがいいのでしょうか？ １０％ですと細胞が分裂・増殖しますので何か影響があるのでは？とも思うです。ただ、その後の実験（RNA回収やwestern）を考えますと細胞が多いほうがやりやすいのですが・・・ 何かご教示ください。 また、リポフェクタミンとベクターを加えたwellは、何も加えていない細胞に比べ、細胞は少し死んでしまい、残りの接着している細胞たちも一部光って見えます。リポフェクタミンLTXなどを加えると、少なからず細胞は死んでしまうものなのでしょうか？

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