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Phos-tag について 削除/引用 No.175-5 - 2007/09/19 (水) 11:40:23 - 木下英司 広島大学の木下英司です（Phos-tagの開発者の一人です）。 この度はPhos-tagをご使用頂き，本当に有り難うございます。 Phos-tagがin vitro kinase assayにうまくワークしていないとのこと，大変ご迷惑をお掛けしております。Phos-tag誘導体についてどのタイプのものをご使用ですか？ビオチン結合型，アクリルアミド結合型，それともパーキンエルマで販売されているゲル染色剤でしょうか？詳しい実験条件等もお聞きしたいと思いますので，出来ましたら上記のメールアドレスまでご連絡頂ければ幸いでございます。 私達の技術が皆様のご研究に少しでもお役に立てることを祈願しております。 それでは，失礼致します。

(無題) 削除/引用 No.175-4 - 2007/09/14 (金) 10:35:16 - MAPK^3 Phos-tagはたいへん素晴らしい試薬ですが、検出感度はそれほど高いとは言えず、RIのそれとは比べものになりません。

原因を切り分ける。 削除/引用 No.175-3 - 2007/09/13 (木) 17:50:07 - baq 何が原因かをまず最初に確かめる必要があります。 私なら次のような方法で原因を探ります。 1) リコンビナント蛋白質に活性がないのか？ -> RI を用いた実験で基質のリン酸化を見る。 2) 検出法の感度が低いのか？ -> lysate から IP したものを kinase assay に用い、 リン酸化された基質を phos-tag で検出

(無題) 削除/引用 No.175-2 - 2007/09/11 (火) 10:44:52 - 通りすがり >kinaseをリコンビナントとして精製してくる場合、注意しなければいけないこと 当たり前の話でおそらく予想しておられるかもしれませんが kinaseに限らず酵素類をリコンビナントで作るときは(特に大腸菌などでは) 当たり前の話ですがfoldingを正しく行わせることや 活性を維持したまま精製させるようにしなければなりませんが タンパクの種類によって違うので単純な解決法はありませんので いろいろ試行錯誤して条件を検討するしかないですね。 あとはリコンビナントで活性がないか、むしろ低いということが 正しい可能性もあります。先の論文で細胞のlysateを用いている場合、単独の分子でなく活性を調節したりする分子と複合体を形成しておりそれらがリコンビナントで単独で発現したときにはないために、ほとんどvitroでは活性が検出されないことはよくあります、その場合は先にそれらの因子を特定しないと難しいですねえ。 phos-tagは使ったことないのでなんともいえませんが、 RIに比べれば感度はおそらく低いのではないでしょうか、 その辺の部分も考慮したほうがよいかもしれません。

リコンビナント蛋白質の　in vitro kinase assay　 削除/引用 No.175-1 - 2007/09/11 (火) 09:18:17 - MOMO リコンビナント蛋白質としてkinaseを精製し、in vitro kinase assayをしたところ、リン酸化のバンドが検出できませんでした。（リン酸化の検出はphos-tagを用いています。） 論文では、その蛋白はkinaseであることは、細胞のlysateを免沈したものをin vitro kinase assayに用いてRIで確かにリン酸化が検出されています。 この論文と大きく違うところは、リコンビナント蛋白であること、検出の方法の2点で、kinase assayのバッファーよりもそちらの2点を疑っています。 kinaseをリコンビナントとして精製してくる場合、注意しなければいけないことなど、in vitro kinase assayに詳しい方がいましたら、教えてください。

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