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(無題) 削除/引用 No.1727-12 - 2008/08/21 (木) 14:23:33 - KN 私もプラスミドを誰かから分譲してもらうを考え、海外の研究者、何人かにメールしました。 あと、＄２５と安く売っていたこともわかり、そこでも買ってみました。 ただ、ハイグロマイシン耐性(hph)の遺伝子のところを後で、自分の好きなインサートを入れたいので、 それを考慮すると、自分で作るのが一番、勝手のいいがいいかなと思い、自分でもまた作り始めました。 形質転換をあくまでも「方法」としているので、自分で作る手間は省きたいところなのですが。。なかなか。 実は、当初はREMIでやろうとしておりまして、プロトプラストの作成までははうまくいったことがあります。 いざ、いれこむDNAを作る段階で、急きょ、アグロを採用して、アグロ用のベクター構築を始めました。 なので、REMIでもやろうかとも思いまして、準備しているところです。 形質転換を利用することが自分の研究の鍵になるところなので、できる限りいろいろなアプローチをしていこうと思ってます。できれば、また、アドバイスよろしくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.1727-11 - 2008/08/20 (水) 23:24:32 - a うーん、そうですか。めげずに頑張ってください。 ところで、ベクターは自分で構築しなければならないのですか？ どこかの研究室から分譲してもらうことはできないですか？ (私もベクターは分譲してもらいました) 実験の目的はわかりませんが、ベクターの構築は本筋ではなくおそらく準備段階でしかないと推察されます。なので、ベクターの構築に時間をかけても得るものは少ない気がします(もちろん勉強にはなりますが)。「自作」ということで疑心暗鬼になりながら実験を進めるのは精神衛生上もよくないですし。 構築するに当たっては、耐性遺伝子カセットはPCRでふやして入れたようですが、他のベクターからプロモーターも含む耐性遺伝子カセットをまるごと切り出してクローニングしてはいかがですか？PCRで増やすとエラーの問題が付きまとうと思います。まあ、シークエンスをきちんと確認すればすむ話ではありますが。 もうひとつ、みもふたもない話ですが、プロトプラストを作ってREMIでやるのどうでしょうか？アグロに比べて多少問題点があるとはおもいますが優れた形質転換法であると思います。

できませんでした 削除/引用 No.1727-10 - 2008/08/19 (火) 16:17:25 - KN いろいろ試してみましたが、形質転換できませんでした。 やはり自作のベクターに問題があるのではないかと思い、再度作り直すことにしました。 今度は、pCAMBIA系のものをつかっていこうと考えてます。 ベクターの構築に関してもいろいろとわからないことがあるので別のトピックにたてたいと思います。 aさん、再三のアドバイス大変ありがとうございました。 次こそは、ここで学んだ形質転換方法を活かして、形質転換体を作りたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1727-9 - 2008/08/11 (月) 14:23:07 - KN とても参考になりました。ありがとうございます。 IM平板にASを添加したものでいくつか仕込みました。 共培養温度も28℃、25℃,22℃とふってみました。 単にIM平板にASがなかったことが原因であったことを願って、結果を楽しみに待っているところです。

(無題) 削除/引用 No.1727-8 - 2008/08/11 (月) 14:13:41 - a �CにASをいれていないのは致命的です。 必ず入れてください ＞�@胞子液の準備(10の6乗〜5乗spores/ml) もし、多数の形質転換体が必要な実験をするのなら、もう少し高密度なほうが実際に得られる形質転換体は増えます(胞子あたりの効率は下がりますが) ＞�D28℃、48時間暗室培養。 共培養を28度で行うのはちょっと温度が高すぎると思います。私の経験上28度でやると非常に効率が下がりました。 ＞ＩＭは希釈するだけなのに対して、こちらではＩＭでさらに培養していることが違っていました。 私も希釈培養しています(O.D.0.12まで←もっと高密度になるまで培養してももちろんかまいません。高効率になりすぎると形質転換体の分離が面倒なので低密度で実験を行っていました) 共培養の平板にＡＳを入れていないのが原因だったのでしょう。もしいれてもうまくいかないのなら今度こそベクターが疑わしいです。 うまくいくと良いですね。

(無題) 削除/引用 No.1727-7 - 2008/08/08 (金) 16:09:01 - KN 私の行った方法を簡単に説明しますと、 ・胞子液を用意する(10の7乗spores/ml) ・アグロをMM液体培地で培養し、IM液体培地(アセトシリンゴンは添加していない)で希釈しOD660が0.12になるまで培養 ・胞子液と上記アグロ液を等量混合 ・混合した培養液200μlをIM平板(アセトシリンゴン200-400μM)上の濾紙に滴下 ・48時間培養[20℃]←20-25℃で最適化が必要かもしれない ・濾紙をハイグロマイシン添加培地に移し、培養です 私の行っている順番です。 �@胞子液の準備(10の6乗〜5乗spores/ml) �AアグロをＬＢで前培養（一晩）OD600=0.4〜0.5ぐらいまで。 �BアグロをＩＭで希釈し本培養 OD600=0.6〜0.7ぐらいまで。 （�Aと�Bは液体培養です、�BにＡＳを入れてます。） �CＩＭ平板上でアグロと胞子けん濁液を混ぜて滴下。 �D28℃、48時間暗室培養。 �Eハイグロマイシン添加培地に移し、１週間〜１０日前後培養。 　�CのＩＭ平板にＡＳ入れてませんでした。また、そちらの方法を伺いますと、ＩＭは希釈するだけなのに対して、こちらではＩＭでさらに培養していることが違っていました。 　バイナリーベクターに一番の問題があるのかもしれませんが、上記の教えていただいた方法（ＩＭ平板にＡＳ添加＆48時間培養時の温度）で、この土日にでも仕込んでみようかと思います。結果はまた後日ご報告いたします。どうもお付き合いいただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1727-6 - 2008/08/08 (金) 14:53:10 - a ＞ＡＳはアグロを本培養するときのＩＭにあらかじめ入れて使用していますか？アグロを使用する数時間前に入れていますか？ ここがよくわからないのですが、これはアグロの前培養(OD660が0.1-0.2くらいになるまで培養するステップ)のことをさしているのでしょうか？もしそうなら、ここでのアセトシリンゴンはあまり形質転換効率に影響を与えない(場合が多い)と思います。菌とアグロの共培養を行うIM平板中に入れる(いれていますよね？)アセトシリンゴンのほうが格段に大きく影響します。 ・あらかじめ、胞子けん濁液とアグロを混ぜてから、濾紙に滴下するのか？ 混ぜてから滴下していました。また、塗り広げたりしなくても特に問題は感じませんでした。 やはり、実験手法というよりベクターに問題があるのかもしれませんね。 私の行った方法を簡単に説明しますと、 ・胞子液を用意する(10の7乗spores/ml) ・アグロをMM液体培地で培養し、IM液体培地(アセトシリンゴンは添加していない)で希釈しOD660が0.12になるまで培養 ・胞子液と上記アグロ液を等量混合 ・混合した培養液200μlをIM平板(アセトシリンゴン200-400μM)上の濾紙に滴下 ・48時間培養[20℃]←20-25℃で最適化が必要かもしれない ・濾紙をハイグロマイシン添加培地に移し、培養 です

(無題) 削除/引用 No.1727-5 - 2008/08/08 (金) 11:45:01 - KN 灰カビの株を変えてみるのも良いかもしれません(可能なら)、株によって大きく効率がかわることもあります。 ＞２、３株使ってるんですが、もう少し多く試してみようと思います。 ベクターのシークエンスは確認したほうが良いと思います。場所によるとは思いますが、数塩基エラーが入ることでうまくいかなくなることがあるかもしれません。 ＞やはりそうですよね。。。何度かやってうまくいかないようだったら、最終的には調べなくてはいけないところですよね。 ところで、共培養はIM平板に濾紙等をしいて、そこにアグロとカビを滴下し、行っていますよね？アグロ菌液と灰カビ胞子液を混ぜて液体培養しているわけではないですよね？ ＞ニトロセルロースの上で混ぜているんですけど、混ぜ方にコツとかあったら教えてください。 ・あらかじめ、胞子けん濁液とアグロを混ぜてから、濾紙に滴下するのか？ ・コンラージ棒で広げてしまってるんですけど、これでいいのかどうか？ ・濾紙がある程度乾くぐらいまでコンラージ棒で広げるのか？少し濡れていてもいいのか？・ ・シロイヌナズナの形質転換（フローラル・ディピィング法(?)）をまねて、適当に液体培養でもやってみたんですが、これもだめでした。。。糸状菌できちんとした液体培養法もあるんでしょうか？ ↑細かいところに気を遣いすぎかもしれませんが、近くで同じような実験をしている人がいないので、細かいところにも気を配っているのですが、あんまり関係ないでしょうか？ これは200μMの意味ですよね？400くらいまであげてみる、もしくは50くらいまで下げてやってみるのも一手かと。 ＞さっそくＡＳの濃度も変化してやってみます。ＡＳはアグロを本培養するときのＩＭにあらかじめ入れて使用していますか？アグロを使用する数時間前に入れていますか？

(無題) 削除/引用 No.1727-4 - 2008/08/08 (金) 00:06:30 - a ＞灰色かび病菌です。 報告はあるものの、多少難しい菌だったかと記憶しております。灰カビの株を変えてみるのも良いかもしれません(可能なら)、株によって大きく効率がかわることもあります。 ＞プロモーター、ターミネーターはTaqを使ってＰＣＲで増やしたものをpBI121に入れたのですが、１塩基、２塩基変化してしまったら動かなくなってしまうことはありますか？ベクター構築が一番の原因なのかとも考えています。 ベクターのシークエンスは確認したほうが良いと思います。場所によるとは思いますが、数塩基エラーが入ることでうまくいかなくなることがあるかもしれません。 ＞２日間でやってます。３日間もいけるでしょうか？ 灰カビは生育が早いと思うのでいけるかわかりませんが、コロニーが大きくなり過ぎないようでしたら試してみるといいかもしれません。 ところで、共培養はIM平板に濾紙等をしいて、そこにアグロとカビを滴下し、行っていますよね？アグロ菌液と灰カビ胞子液を混ぜて液体培養しているわけではないですよね？ ＞アグロが前培養または本培養時にダマになることがあるのですが アグロの株によっては凝集しやすいものもあるみたいです。私も凝集してしまっていたのですができました(あまりいいことではないかと思いますが)。 ＞200mM/ml これは200μMの意味ですよね？400くらいまであげてみる、もしくは50くらいまで下げてやってみるのも一手かと。

(無題) 削除/引用 No.1727-3 - 2008/08/07 (木) 11:31:33 - KN なんというカビをお使いですか？ ＞灰色かび病菌です。アグロでの形質転換は確立しているので、問題は自分の技術やアグロやベクター構築に問題があるのかと思っています。灰色かび病菌は論文にあるように、胞子けん濁液を使用しています。 別のベクターを入手し使っている菌を形質転換しうまくいくかみる、 作ったベクターで別の菌(Fusariumとか)を形質転換するかしてみるのはどうでしょう？ ＞別の菌で試してみたいと思います。 また、そもそもベクターはアグロに確実に導入されているのでしょうか？ ＞アグロからプラスミドをとって、ＰＣＲで確認した程度ですが、カナマイシンで選択されておりますし、導入されていると思います。 ・アグロの株を変える ＞手持ちの株が１株しかないので、これは残念ながら試せません。 ・co-culture時のアグロの密度を相対的に高くする ＞アグロの密度や灰色かび病菌の胞子数等を変えていますが、できませんでした。 ・co-cultureの時間を長くする ＞２日間でやってます。３日間もいけるでしょうか？ ・co-culture時のアセトシリンゴンの濃度を高くする ＞200mM/mlの濃度で通常の論文どおりで行っています。 ■アグロの前培養はＬＢで行い、本培養は多くの論文で使用されていたInduction Mediumを用いています。アセトシリンゴンは本培養にしてからすぐに添加、または共培養３時間前に添加、とアセトシリンゴンの添加時期も変えてみました。アグロが前培養または本培養時にダマになることがあるのですが、そこらへんは影響ないかどうかご存知でしょうか？ ■プロモーター、ターミネーターはTaqを使ってＰＣＲで増やしたものをpBI121に入れたのですが、１塩基、２塩基変化してしまったら動かなくなってしまうことはありますか？ベクター構築が一番の原因なのかとも考えています。 とりあえず、別の菌で行ってみたいと思います。ご親切にアドバイスしてくださってありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1727-2 - 2008/08/06 (水) 21:56:28 - a なんというカビをお使いですか？ ものによってはうまくいかない場合もあるようです。 ベクターが機能しているか否かは、 別のベクターを入手し使っている菌を形質転換しうまくいくかみる、 作ったベクターで別の菌(Fusariumとか)を形質転換するかしてみるのはどうでしょう？ また、そもそもベクターはアグロに確実に導入されているのでしょうか？ 具体的にどんな条件で実験しているのかわかりませんが、 ・アグロの株を変える ・co-culture時のアグロの密度を相対的に高くする ・co-cultureの時間を長くする ・co-culture時のアセトシリンゴンの濃度を高くする などで形質転換効率があがる場合もあります。 論文を参考にされているのなら アグロの培養などでミスるのは考えにくいかと。 (試薬・培地がちゃんと作れていることが前提ですが) 極論すれば、カビ細胞とアグロを混ぜてアセトシリンゴン存在下で培養するだけですから。

アグロバクテリウムで糸状菌の形質転換 削除/引用 No.1727-1 - 2008/08/06 (水) 17:28:58 - KN アグロバクテリウム法を用いて、糸状菌に形質転換していますがうまくいきません。 バイナリーベクターはpBI121で、プロモーターとターミネーターはAspergillus nidulansからとって入れました。インサートは別のベクターからとったハイグロマイシン耐性遺伝子です。 同じような論文をたくさん参照にしてますが、うまくいきません。自作のベクターが機能しないのか、それともアグロの培養がいけないのかわかりません。なにかコツのようなものがあれば教えてください。お願いします。

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